Технология продовольственных продуктов и перерабатывающих производств

Содержание
ВВЕДЕНИЕ …………………………………………...………………………….7
1.Обзор литературы
1.1 Особенности взаимодействия вирусов с растительной клеткой – хозяином………………………………………………………………………….10
1.2 Вирусные болезни груши и их вредоносность…………………………….13
1.3 Диагностика вирусов и вирусных болезней……………………………….14
1.4 Терапия……………………………………………………………………….25
1.5 Микроклональное размножения …………………………………………...32
1.5.1 Образование придаточных побегов непосредственно из тканей эксплантат………………………………………………………………………..40
1.5.2 Этапы клонального микроразмножения…………………………………45
1.5.3 Применения клонального микроразмножения и его перспективы…….50
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Объекты методика исследований ………………………………………….51
2.2 Результаты исследований………..………………………………………….57
III. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ВЫРАЩИВАНИЯ 1тыс.шт. САЖЕНЦЕВ ГРУШИ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМ МЕТОДАМ (in vitro)
IV.ОРГАНИЗАЦИЯ ОХРАНЫ ТРУДА В ЛАБОРАТОРИИ
4.1Меры безопасности при работе с оборудованием лаборатории вирусологии……………………………………………………………………...65 4.2 Порядок работы мерисистемной комнате………………………………….66 4.3 Инструкция по охране труда для работающих в теплице………………..67 V. ПРАВИЛА ПОЖАРНОЙ БЕЗОПАСНОСТИ В ЛАБОРАТОРИЯХ
VI. ОХРАНА ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
VII. ЗАКЛЮЧЕНИЕ….………………………………………………………..75
VIII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ……………….……………………………...80
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ВИРУСОВ С РАСТИТЕЛЬНОЙ
КЛЕТКОЙ-ХОЗЯИНОМ

Вирусная инфекция растений достаточно сильно отличается от инфекции животных и бактерий. Прежде всего, это отличие выражается в способе заражения растительной клетки. Вирусы растений обычно проникают в организм только через травмы. Плотная наружная оболочка растительной клетки непроницаемая для вирусов и для успешного заражения она должна быть повреждена. Большинство вирусов животных и человека, напротив, заражают неповрежденные клетки. Растительные клетки, ферментативным путем освобожденные от клеточных оболочек (протопласты), ведут себя подобно клеткам животных: их можно заразить, добавив вирус к среде, в которой они суспензированы [2].
Вирусы вызывают у растений самые различные патологические изменения. Инфекция может затронуть практически все стороны жизни растений. Наиболее часто наблюдаются изменения в окраске (хлороз), отмирание (некроз) или деформация. Изменения, вызываемые вирусом в зараженном растении, можно подразделить на 3 категории:
1) морфологические изменения или симптомы;
2) гистологические и цитологические изменения;
3) метаболические изменения.
Для большинства вирусов растений характерно системное поражение их хозяев (т.е. вирус перемещается от первичного места инокуляции в другие части растения). Однако при этом не обязательно будут поражены все клетки. Поселившись в растении, вирус, как правило, присутствует в нем вплоть до гибели растения и при вегетативном размножении переходит к потомству. Наиболее тяжелым, но не самым частым результатом вирусной инфекции является гибель клеток, тканей или всего растения-хозяина. Многие вирусы, при их втирании в листья растений-индикаторов, вызывают появление некрозов на инокулированных листьях, причем это не всегда останавливает распространение вируса по растению. Некрозы появляются не только на зеленых частях растений, но и на этиолированных листьях и даже корнях. На черешках и стеблях появляются полоски мертвой ткани.
Описанные выше симптомы связаны с соответствующими гистологическими изменениями в растении. Так, хлоротичная ткань листа, на котором обнаруживается крапчатость, обычно развита слабее (т.е. она тоньше в поперечном срезе) нормальной зеленой ткани; палисадные клетки оказываются при этом короче и в них содержится меньшее число хлоропластов. Некоторые вирусы вызывают появление некрозов во флоэме (это особенно характерно для вирусов, являющихся возбудителями таких болезней, как скручивание листьев, желтуха). Гипертрофический рост, приводящий к образованию опухолей и энаций, отражается на гистологическом строении растений, но помимо этого наблюдаются и другие изменения. Многочисленные изменения можно наблюдать в тонкой структуре инфицированных клеток. Некоторые вирусы губительно влияют на те или иные органеллы клеток. Однако наиболее характерным цитологическим изменением является присутствие самих вирусных частиц. Обычно они локализованы только в цитоплазме, но некоторые вирусы проникают и в другие части клетки. Так, частицы одних штаммов ВТМ (вирус табачной мозаики) находится только в цитоплазме, в то время как другие можно обнаружить также в хлоропластах или ядрах.
Вирус нарушает обмен нуклеиновых кислот в зараженной клетке и тем самым оказывает влияние на синтез белка и ДНК, изменяя их таким образом, что в результате образуются новые вирусные частицы. Влияние вируса на метаболизм растения-хозяина носит характер «вмешательства» вируса в жизнедеятельность клеток пораженной ткани. Мозаика, крапчатость и пожелтение листьев, т.е. явления, сопровождающиеся снижением активности хлорофилла, свидетельствуют о том, что так или иначе затронуту фотосинтетический аппарат. Аномальный рост вирусных растений свидетельствует о нарушении процессов, ответственных за регуляцию роста.
При размножении в живых клетках растений, вирусы проходят две фазы развития – вегетативную и покоя.
В вегетативную фазу вирус, например, табачной мозаики активно размножается, но его инфекционные свойства слабые. В фазе покоя прекращается размножение вируса, а вирусные частицы приобретают свойства к сохранению и распространению в природе. В этой фазе вирус является высоко инфекционным. Нуклеиновая кислота вируса встраивается в геном, т.е. нуклеиновую кислоту инфицированного растения и при удобном случае проявляет свои инфекционные свойства. Такие вирусы приносят наибольший вред растениям.
Вирусы не обладают способностью размножаться вне живого растения, но некоторые из них могут долгое время сохраняться в мертвых, сухих остатках растений не теряя при этом инфекционной способность. Так, например, вирус табачной мозаики сохраняет свою активность в сухих листьях и стеблях 3-4 года, а в сухом табаке до 50 лет. В тоже время, есть вирусы, обладающие слабой устойчивостью, и инфекционность сохраняют короткий период времени. Например, вирус скручивания листьев картофеля, сохраняет инфекционность в сухом растении и выжатом соке свежего растения всего несколько минут.
Вирусы переносят довольно легко низкие температуры (ниже 0) не теряя при этом своей инфекционности.
Процесс заражения растения заключается в проникновении вируса в клетку. В природе заражение происходит через ранки, образовавшиеся механически или с помощью переносчиков. Если просто опрыскать неповрежденные листья растения соком, выжатым из больного растения (инокулюмом), то заражения не произойдет. При ручной инокуляции поверхность листа слегка повреждают путем легкого втирания порошка карборунда и затем ватным тампоном втирают инокулюм. Проникнув в клетку вирусные частицы, утратив свою белковую оболочку, начинают воспроизводить вирусные компоненты из генома растительной клетки и производить сборку новых вирусных частиц. Вирусные частицы медленно перемещаются из клетки в клетку с потоком питательных веществ и при делении клеток меристематических тканей. Как правило, перемещение вируса от побега к корням совершается с большей скоростью, чем в обратном направлении. Некоторые вирусы не способны заселять верхушечную меристему, другие, наоборот, легко проникают в эту ткань. Однако, концентрация вирусов в меристемах очень низка. Клетки меристемы освобождаются от вирусной инфекции за счет разницы между скоростью роста побегов (400 мк/ч) и скоростью распространения вируса (100мк/ч), что позволяет клеткам меристем как бы «убегать» от вирусной инфекции. Эта особенность используется при размножении растений из культуры тканей для получения безвирусных растений.

1.2. ВИРУСНЫЕ БОЛЕЗНИ ГРУШИ И ИХ ВРЕДОНОСНОСТЬ

Вирусные болезни плодовых культур, особенно имеющие высокую вредоносность, серьезно изучаются со второй половины прошлого века.
Имея хроническое течение заболевания, системно поражая растения, вирусы и микоплазмы вызывают различные патологические изменения, нанося растению необратимые изменения метаболизма, что часто приводит к его гибели. Это наносит плодоводству экономической ущерб, величина которого зависит от степени распространения вирусов, их вредоносности и восприимчивости сорта. Из-за системности поражения инфекция затрагивает все органы растения. У плодовых растений вирусные болезни задерживают развитие интенсивности роста побегов и корней по сравнению со здоровым растениям более чем в 2 раза [3]. Некоторые вирусные заболевания резко снижают количество и качество урожая.
Некроз груши снижает урожай на 40-90% [4], а от истощения погибают сотни тысяч грушевых деревьев [5].
При поражении вирусом пролиферации груши прирост побегов снижается на 20-41%, а урожай на 11-97%. Вирус мозаики листьев груши вызывает снижение прироста побегов на 42-50%, урожай при этом падает на 66%. Вирусные болезни влияют на качество плодов, Так, здоровые деревья имеют 71,3% гладкой поверхности плодов, а больные – только28,4%.

1.3.ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ И ВИРУСНЫХ БОЛЕЗНЕЙ

Несмотря на установленные различия между вирусами и микоплазмами, согласно которых вирусы – это нуклеопротеиды, содержащие один тип нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), а микоплазмы – полиморфные бактериоподобные организмы, лишенные настоящей клеточной стенки (вместо нее они имеют трехслойную цитоплазматическую мембрану), содержащие ДНК и РНК и размножающиеся на искусственных питательных средах, вирусные и микроплазменные болезни рассматриваются обычно вместе, Это объясняется тем, что методы диагностики и меры борьбы с микоплазменными и вирусными заболеваниями не различаются [6].
Диагностировать можно как вирусы, так и симптомы болезней, вызываемые ими.
Таблица 1. Диагностика вирусов и микоплазм груши Юго-востока Казахстана

ГРУША: 1 2 3 4 5
Кольцевая мозаика (Pear ring pattern mosaic) + + + +
Пожелтение жилок и красная пятнистость листьев (Pear vein yellow; Pear red mottle) +
+
Истощение и отмирания груши (Pear decline virus) + + +
Ямчатость древесины груши (Pear stem hitting virus) +
Отмирание коры груши (Pear decline bark) +
Каменистость плодов груши (Pear stony pit) +
Примечание: 1 – визуальный осмотр; 2 – травянистые индикаторы; 3 – древесные индикаторы; 4 – серологический метод; 5 – переносчики; **- Шарка диагностировалась PCR-анализом.
Диагностика вирусных болезней осуществляется по 2 признакам: 1) определение инфекции по внешним признакам и 2) по внутренним симптомам.

- Определение инфекции по внешним признакам

Вирусы и микоплазмы вызывают нарушения нормального роста и развития растений. Визуально их воздействие проявляется, как правило, в виде различных симптомов местного или системного характера – мозаик, некрозов, кольцевых пятнистостей, задержки или, наоборот, усиления ростовых процессов. При микоплазмах более выражены признаки реверсии цветков, израстания и общей карликовости. Симптомы не всегда специфичны. Их проявление варьирует в зависимости от вида возбудителя, сорта растений, климатических условий, влияния сопутствующих инфекции (при комплексном поражении) и других факторов. Вместе с тем, для отдельных заболеваний характерны определенные признаки, Например, образование ярко желтых, очерченных пятен и вытянутых колец, расположенных на пересечении жилок при кольцевой мозаики груши, пожелтение жилок и красная пятнистость листьев груши. Основным недостатком визуального анализа является то, что с его помощью не удается диагностировать скрытые (латентные) формы заболеваний.
Маточные черенковые деревья культурных сортов, маточники вегетативно размножаемых подвоев и маточные семенные деревья должны ежегодно подвергаться осмотрам [7]. С целью повышения надежности и достоверности состояния плодовых растений, внешний осмотр проводят дважды в течение вегетации. Первое обследование делают весной – в начале лета, когда лучше заметны признаки заболеваний на листьях (различные мозаики, деформации, некрозы), некоторые их типы на побегах (израстание, прекращение роста), цветах (изменение окраски и реверсия). Сюда относятся следующие заболевания: на яблоне – мозаика, на груше – кольцевая мозаика. Отчетливо проявляются симптомы заболевания, связанные с поражением плодов груши, айвы. На груше – пожелтение жилок и красная пятнистость листьев, болезни отмирания груши, вишни, персика, сопровождаемые ранним пожелтением или покраснением и скручиванием листьев, растрескивание, огрубение и шелушение коры груши.
Полученные при визуальном анализе сведения обычно используются для предварительных выводов о природе заболевания. В сомнительных случаях, а также при диагнозе скрытых инфекций он дополняется другими методами – индикаторным, серологическим и молекулярными – PCR. Следовательно, выбор методов диагноза, различающихся по степени чувствительности и точности, зависит от определяемого типа поражения и условий проведения оценки.

-Диагностика по внутренним симптомам

Вирусная инфекция вызывает изменения в анатомии и метаболизме больного растения, которые, можно установить соответствующими методами.
1. Гистологические методы диагностики. Многие желтушные вирусы локализованы во флоэме, вплоть до некрозов. Методом Игель-Ланге [8] диагностируют зараженность клубней картофеля вирусом скручивания по отложению каллезы в сосудах, которая окрашивается резорцином в синий цвет.
Вирус размягчения древесины плодовых деревьев вызывает разрушение, которое можно установить по окрашиванию срезов древесины флороглюцином.
Поражение ксилемы цитрусовых, зараженных псорозисом, можно выявить по окрашиваемости тионином или профлавином.
2. Биохимическое методы диагностики. Зараженность растений вирусами устанавливают и по некоторым изменениям в метаболизме: по увеличению содержания свободных аминокислот; по повышению концентрации редуцирующих сахаров; по повышению интенсивности дыхания и активности окислительных ферментов; по усилению люминесценций тканей вследствие увеличения концентрации фенольных соединений (скополетина и др.).
Однако все эти методы имеют существенный недостаток – низкую достоверность. Изменения в метаболизме, которые регистрируются данными методами, не являются специфическими, а представляют собой интегрированный (почвенные и клематические факторы, заражение другими инфекционными агентами, механическое повреждение и др.). Поэтому широкого распространения подобные методы не нашли, однако как дополнительные они могут быть полезными, особенно в тех случаях, когда другие методы трудно применять.
Значительно больше методов основано на диагностике самых вирусов. В этих целях обычно используют заражение индикаторных растений, серологической метод в разных модификациях и в последнее время, для диагностики вирусов, используют молекулярные методы – PCR анализ с секвенированием нуклеиновых кислот и белков вирусов.

Тестирование на травянистых индикаторах

Биологические тестирование – это предварительный тест, используемый для выявления вирусов, которые переносятся с соком растений.
Открытие J.D.Moore, Boyle I.S., and G.W.Keitt [9] способности вирусов переходить с плодовых культур на травянистые растения и накапливаться в них используется учеными в различных направлениях. Исследуется круг восприимчивых травянистых растений-хозяев для непосредственной диагностики сокопереносимых вирусов плодовых культур. Изучаются растения-дифференциаторы, позволяющие различить сходные, но самостоятельные вирусы, и растения-фильтры для выделения отдельных вирусов из семей. В соке травянистых индикаторов исследуются свойства, позволяющие судить об их термостойкости, концентрации в зараженных тканях, времени сохранения инфекционности in vitro.
Перенос вирусов, поражающих плодовые культуры на травянистые индикаторы является необходимым этапом для их точной индентификации. Однако осуществить перенос вирусов плодовых трудно, поскольку мешают окислительная активность ферментов: полифенолоксидаза, танины, хиноны, кислотность сока, низкая концентрация вируса в тканях плодовых. Для успешного переноса вируса необходимо стабилизировать вирус в соке плодовых растений. Для защиты вирусов от быстрой инактивации в момент растирания тканей плодовых используются различные стабилизирующие вещества: ДИЕКА (диэтилдитиокарбамат натрия), который инактивирует фермент полифенолоксидазу, блокируя в ней ион меди [10], никотин-сульфат или никотин-основание, кофеин. Эти вещества освобождают вирусы из комплексов вирус-танин. Тиогликолят натрия, 2-меркаптоэтанол, ЕДТА (этилендиаминтетраацетат натрия) защищают вирусы от необратимого ингибирования хинонами. Для связывания фенольных компонентов применяют поливинилпирролидон М-10000(PVP-10)-2-5% и полиэтиленгликоль (ПЭГ-М-6000) 1-4% [11,12]. Также с этой целью применяют тиомочевину, сульфит натрия, аскорбиновую кислоту, активированный уголь, бентонит.
После переноса вируса на какие-либо травянистые растения изучается круг восприимчивых растений-хозяев, выделяются растения с местной некротической реакцией, позволяющие быстро устанавливать присутствие вируса и его концентрацию в исследуемых тканях.
Механическое заражение листьев травянистых индикаторов проводят растительным материалом, предварительно растертым в ступке с добавлением стабилизирующих смесей. Эти смеси позволяют стабилизировать лабильные плодовые вирусы и сохранить PH среды нейтральной.
Стабильизирующая смесь инокулюма для лепестковых:
0,01 М трис/HCI буфер pH 7,5 или 0,1 M боратный буфер pH 9,0.
0,005 M MgSO4
0,1% Na2 SO3
0,1% аскорбиновая кислота
1,0% p-p никотин основания
Инокулюма из молодых листьев косточковых:
0,03 M фосфатный буфер pH 8,5;
0,015 M диэтилдитиокарбомат натрия;
0,015 M дифенилдитиомочевина;
0,03 M кофеин.
Иноклюм из косточковых культур можно готовит с 0,1% никотиноснованием без других добавок, но во избежание ожогов, после заражения, растения тщательно отмываются.
Метод применяется в теплицах. Лучше всего проводить анализ весной (в марте-мае). Для анализа растений берут одну весовую часть молодых листочков, покоящихся почек (без кроющих чешуй), лепестков или измельчают и растирают в ступе с тремя объемами раствора, содержащего 2% никотин-сульфата или 0,015 М ДИЭКА и 0,5 2-меркаптоэтанола в 0, 01М фосфатом буфере с pH =7,5. Вместо никотин-сульфата можно использовать 2% раствор кофеина. Листья перед заражением припудривают только тонко измельченным карборундом. Индикаторные растения в количестве 10 шт. на каждый вирусный изолят натирают инокулюмом. В качестве травянистых индикаторов используют растения семейства Cucumis sativus, Chenopodiaceae, Leguminoseae, Nicotianae. Растения огурца заражают в стадии семядольных листьев, а фасоли – при распусеании 5 настоящих листьев.
Реакция на травянистых индикаторах, рекомендуемых для диагностики, не является специфичной. Сходные симптомы вызывают различные возбудители. Поэтому при идентификации выявленных инфекций вводят дополнительные индикаторы, обладающие характерной реакцией на заражение.

-Основное тестирование на древесных индикаторах

Проверка на древесных индикаторах с помощью чего – обязательный этап диагностики плодовых растений. Это метод отличается высокой надежностью.
Все клоны, свободные от вирусов по данным проверки методами ИФА, ИЭМ, а также теста на травянистых растениях, подвергаются основному тестированию. В основном тесте выявляются все сокопереносимые и непереносимые соком вирусы, микоплазмы и вироиды, известные в настоящее время.
В качестве индикаторов применяют восприимчивые виды, сорта, специфично и стабильно реагирующие на инфекции и наиболее быстро проявляющие признаки заболевания.

Индикаторы и выявляемые вирусы груши и айвы:
1. Pyrus comimunis (Beurre Hardy) – кольцевая мозаика, пожелтение жилок, некроз коры, растрескивание коры, опадение почек, отмирание груши.
2. Willifms – растрескивание коры, огрубение коры, рак коры груши.
3. Lord Lambourne – размягчение древесины.
4. Pyronia veitchii – пожелтение жилок и красная пятнистость, отмирание груши.
5. Cydpnia oblonga (с 7/1)-хлоротическая пятнистость листьев, латентные вирусы груши.
6. Virginia crab – ямчатость древесины, бороздчатость древесины.
7. P. aromatica, P. communis (Magness, Precocius) - истощение и отмирание груши.

Первая предварительная проверка внешне здоровых маточных деревьев яблони и груши проводится в условиях теплицы на древесных индикаторах [13] . На сеянцах яблони и груши в теплице делают двойную окулировку, т.е. на подвой окулируют 2 глазка – нижний с исследуемого дерева, а верхний – с древесного индикатора. Двойная окулировка позволяет в короткий срок диагностировать вирусы. Сущность ее заключается в том, что на выращенный подвой (саженец) вначале окулируют глазок от черенка индикатора. В случае наличия инфекции в проверяемом сортообразце (промежуточной почки) она передается при движении сока от привоя к индикатору. Этот метод позволяет провести диагностику вируса через 3-4 месяца. Для окулировки обычно применяют Т-образную окулировку щитком без древесины или, если кора на подвое плохо отстает, то ее осуществляют щитком с толстым слоем древесины.
В первом случае на коре молодого подвоя делают Т- образный надрез, приподнимают края надрезанной коры, под которую вставляют почку со щитком индикатора. Щиток должен полностью поместиться в разрезе, а почка должна остаться открытой. Кору плотно прижимают и обвязывают пленкой. При пробуждении почки верхнюю часть подвоя выше прививки удаляют и наблюдения ведут за проявлением симптомов на отрастающем побеге от привитой почки индикатора. ....