Витальный метод изучения половых клеток животных

Содержание
Аннотация....................................................................................................................2
Нормативные ссылки..................................................................................................3
Определения................................................................................................................4
Обозначения и сокращения........................................................................................5
Введение ......................................................................................................................6
1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных........................8
2. Извлечение эмбрионов..........................................................................................15
2.1. Хранение эмбрионов..........................................................................................16
3. Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного....................................18
3.1. Капацитация сперматозоидов............................................................................21
3.2. Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий
развития эмбрионов...................................................................................................23
Техника безопасности ..............................................................................................25
Заключение ................................................................................................................26
Список использованной литературы........................................................................27
Введение
Биология – это наука, которая в наши дни активно развивается и огромные надежды возлагаются именно на биотехнологии. Сейчас методы биотехнологии внедряются в промышленность, сельское хозяйство и медицину. Генетическая инженерия, клеточная инженерия и конечно клонирование наиболее актуальны в XXI веке и к сожалению в школе не в полной мере рассматривают эти темы. Я выбрал именно эту тему для своей работы так как хочется узнать больше о направлениях современной биологии.
Биотехнология, использование живых организмов и биологических процессов в промышленном производстве. Развивается микробиологический синтез ферментов, витаминов, аминокислот, антибиотиков и т.п. Перспективно промышленное получение других биологически активных веществ (гормональных препаратов, соединений, стимулирующих иммунитет, и т.п.) с помощью методов генетической инженерии и культуры животных и растительных клеток.
Биотехнология (от греч. bios — жизнь, techne — искусство, мастерство и logos — слово, учение), использование живых организмов и биологических процессов в производстве. Биотехнология — междисциплинарная область, возникшая на стыке биологических, химических и технических наук. С развитием биотехнологии связывают решение глобальных проблем человечества — ликвидацию нехватки продовольствия, энергии, минеральных ресурсов, улучшение состояния здравоохранения и качества окружающей среды.
Скорость генетического улучшения, которая может быть достигнута в пле¬менных программах повышения воспроизводительной способности живот-ных, имеет в настоящее время большое теоретическое и практическое зна-чение.
В данное время возникает острая потребность изучения вопросов физи-ологии генетической изменчивости и биологических критериев воспроиз-водительных качеств у животных. Это сравнительно новое и быстро разви-вающееся направление в Генетике и биотехнологии животных. Выявление признаков, по которым можно предсказать генотип у животных по физиоло-гическим параметрам представляет большой научный интерес. Понимание механизма, контролирующего рост, развитие и созревание овулирующих фолликулов, оплодотворение гамет и эмбриональное развитие плода, мог¬ло бы способствовать выявлению селекционных критериев генетического улучшения воспроизведения, что очень ценно для разработки новых приемов наследственно обусловленного повышения плодовитости животных. Селек-ционные аспекты разведения во многом определяются процессами, способ-ствующими регулированию биологических качеств животных. И не секрет, что одним из основных путей регулирования этих процессов является био-технология.
В основу методов биотехнологии легли теоретические разработки по ис-кусственному осеменению, гормональному регулированию воспроизводи-тельной функции, трансплантации эмбрионов у животных. Перспективы ис-пользования методов биотехнологии в практике разведения животных столь грандиозны, что уже сегодня в ряде стран эти исследования поставлены на коммерческую основу В зоотехнии по биотехнологии животных в данном направлении сделан огромный прогресс
«Биотехнология животных» состоит из четырех частей: основы лабораторного дела, эмбриотрансплантации, эмбриокультуры и эмбриоинженерии.
1. Витальный метод изучения репродуктивных клеток животных
Витальный метод изучения репродуктивных клеток и эмбрионов живот-ных основан на исследовании живой клетки. Для использования витального метода исследования репродуктивных клеток животных необходимо нали¬чие питательной среды и микроскопа.
Питательная среда. После извлечения из репродуктивного тракта гаме¬ты и эмбрионы помещаются в питательную среду (в «культуру»). При этом питательная среда должна полностью обеспечивать все внешние условия, которые имелись при условиях in vivo, так как только в этом случае возможно сохранение их жизнедеятельности, обеспечение факторов для созревания гамет, их оплодотворения и дальнейшего эмбрионального развития.
Ингредиенты, входящие в состав сбалансированного солевого раствора Эрла для культивирования эмбрионов и ооцитов in vitro
Состав Характеристика
EBS Сбалансированный солевой раствор Эрла, в 10 - кратной концентрации, без бикарбоната натрия
Вода Дистиллированная
Бикарбонат натрия В виде раствора
Пируват натрия Основной раствор 1,1 мг/мл
Пенициллин 600 мг/мл
Гентамицин 10 мг/мл
Гепарин 0,2 мл, содержащие 5000 ME.
БСА -
HEPES 5,96 г/100 мл
Среда, обеспечивающая рост и развитие биологических систем благодаря наличию в своем составе компонентов, необходимых для нормальной жизнедея¬тельности клеток, называется питательной (культуральной). По химическому со¬ставу питательная среда, в среднем, состоит из 80-90% воды, 10-15% белка, 2% липидов, 1% углеводов, 1% нуклеопротеидов, 1 -1,5% неорганических веществ.
Основными требованиями при подготовке питательных сред являются растворимость компонентов, отсутствие токсичности и стабильность. При эмбриокультуральных исследованиях в животноводстве питательная среда выполняет следующие важные функции:
1. Обеспечивает питательными веществами, гормональными фактора¬ми развития, ферментами, витаминами, транспортными белками, липидами, минеральными компонентами, так как они все в комплексе необходимы для нормальной жизнедеятельности клеток.
2. Создает физико-химические условия для полноценного развития (рН, осмолярность).
Среды можно приобрести в готовом виде. Выпускаются они в жидком виде (в десятикратной концентрации), или в форме порошка (EBS, F10). Од-нако многие исследователи готовят среды самостоятельно, поскольку это дает возможность контролировать каждый ингредиент.
Среда для промывания фолликулов и работы с эмбрионами
Состав Процедура
А. Для приготовления 400 мл EBS, забуференного HEPES без антибиотика
Пируват натрия 1,1 мг/мл
1 Бикарбонат натрия 0,1348 г растворить в 20 мл волы
EBS В 295 мл воды добавить 40 мл EBS, 1.1 мг/мл пиру-вата натрия; затем медленно (для предотвращения образования осадков) пипеткой добавить раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая. Полу¬ченный раствор должен быть прозрачным.
HEPES Ввести 33,6 мл
Проверить режим полученной среды: осмолярностъ, рН, t.
В. Среда для получения ооциток
Гепарин 350 мкл гепарина добавить к 3S0 мл EBS. забуференного HEPES. Стерилизовать миллипоровой фильтрацией.
С. Приготовление среды для переноса эмбрионов
Сыворотка 2 мл инактивированной нагреванием сыворотки добавить к 18мл HEPES. Стерилизовать фильтраци¬ей.
В лабораторных условиях питательные среды готовят в 1 -литровом объеме. При этом ингредиенты растворяют примерно в 700 - 800 мл воды. Соли раство¬ряют в той последовательности, что приведено в рецепте. После окончания про¬цедур, связанных с растворением ингредиентов, объем раствора доводят до 1л и, после чего, проводят его стерилизацию под давлением через миллипоровые фильтры или автоклавированием (1 атм, t =1150С; в течение 20 - 35 мин.). После охлаждения через раствор бикарбоната натрия пропускают СО2. Сыворотка, бел¬ковые добавки (например, инсулин и др. гормоны) хранятся при температуре минус 200С и добавляются непосредственно перед использованием.
В зависимости от химического состава различают три категории сред:
1. Среды с сывороточными добавками. Клетки выращиваются в основном среде содержащей небольшое количество сыворотки и обобщенной сывороточными добавками.
2. Среды с заменителями сыворотки. Клетки выращиваются в основной среде, в которую добавлены определенные заменители сыворотки.
3. Бессывороточные, которые, в свою очередь, подразделяются на три подгруппы:
а) простые (белки отсутствуют);
б) специальные (содержат очищенные бел¬ки, гормоны, ферменты, витамины);
с) неопределенные (экспериментальные среды, в составе которых имеются "неопределенные" биологические добавки).
Среда для оплодотворения in vitro
Ингредиент Процедура
А. Для получения 100 мл исходного раствора EBS. забуференного бикарбонатом
Пируват натрия Основной раствор 1,1 мг/мл
Бикарбонат натрия 0,21 г растворить в 10 мл волы
EBS К 10 мл десятикратного раствора добавить 77 мл воды, пируват натрия: после чего медленно внести с помощью пипетки раствор бикарбоната натрия, осторожно встряхивая (важное условие - раствор должен получиться прозрачным)
Антибиотики Добавить 10 мкл раствора пенициллина и 0,2 мл раствора гентамицина
В. Приготовление среды для оплодотворения in vitro
БСА 0,4 г + 80 мл EBS и оставить для естест¬венного постепенного растворения. Профильтровать через миллипоровые фильтры.
Среда для культивирования эмбрионов
EBS 0,4 мл + 0,4 мл инактивированной сыворотки. Про-фильтровать через миллипоровые фильтры. Использовать по 100-500 мкл под маслом для культивиро¬вания эмбрионов, начиная со стадии пронуклеусов.
Приготовление сыворотки материнской крови
Ингредиент Процедура
Кровь 10-15 мл
Центрифугировать немедленно в настольной центрифуге 5-10 мин. при 1000 g. Воспользовавшись пастеровской пипеткой перенести плазму в стерильную пластиковую пробирку. Оставить пробирку с плазмой для свертывания. Убрать фибриновый сгусток. Инактивировать нагреванием в водяной бане при 560С в течение 30 мин. Профильтровать. Остаток можно заморозить.

Среды, в составе которых компоненты, необходимые для поддержания жизни, роста и развития сведены до минимума, относят к минимальным.
Среди биологических сред наибольшее распространение получила сы-воротка, т.к. она пригодна для культивирования клеток вне организма. Добавление 5 - 20% (по объему) сыворотки все еще остается необходимым для поддержания роста и развития клеток.
В питательной среде сыворотка выполняет следующие функции: служит буфером для лабильных и водонерастворимых питательных веществ; нейт-рализатором токсинов; поставщиком гормонов, пептидных факторов роста, незаменимых питательных низкомолекулярных веществ и, кроме того, сы-воротка обладает защитным эффектом.
В зависимости от назначения питательные среды также делят на четыре группы:
1) среды, используемые для культивирования гамет (среда Хэнкса, Тироде);
2) среды, используемые для оплодотворения гамет (среда Т6, ра¬створ Кребса-Рингера);
3) среды, используемые для культивирования эмб¬рионов (среда Виттена);
4) среды используемые для замораживания гамет и эмбрионов.
Основной режим питательной среды для культивирования гамет и эмб-рионов должен быть следующим.
1) осмотическое давление находится в пределах 280-290 мОсмоль/л. Если клетку содержать в среде с превышающим ее уровень осмотическим давлением -она будет сжиматься и сморщиваться, если же наоборот- клетка будет набухать и разрываться.
2) температура считается оптимальной в пределах 37-37,50С.
3) рН находится в пределах 7,2 (при культивировании) и 7,4 (при опло-дотворении).
4) наличие в воздухе 5% СС^, а в смеси - 5% кислорода, 90% азота, 5% углекислого газа (для этой цели среду необходимо эквилибрировать).
Состав-основных питательных сред
№
Компонент Среда, г/л
Т6 Виттена
РВ1
1 NaCl 5,719 4,140 8000
2 KCL 0,106 0,356 0,200
3 MgCl2H2O 0,096 - -
4 Na2HPO412 H2O 0,129 - 2,898
5 СаС122 H2O 0,262 - 0,132
6 КН2РО4 - 0,162 0,200
7 MgSO4H2O - 0,294 -
8 NaHCO3 2,101 -
Добавки (вводятся непосредственно перед работой)
Лантат натрия 2,791 6,235 -
Пируват натрия 0,052 0,036 0,036
Лактат кальция - 0,527 -
Глюкоза 1,0 1,0 1,0
БСА - 3,0 3,0
Стрептомицин 0,050 0,05 -
Пенициллин 0,060 0,075 0,060
Феноловый красный 0,010 - 0,010
Микроскоп. Устройство оптических приборов основано на законах преломления и отражения света, которые известны из курсов физики. На этом останавливаться здесь мы не будем и ограничимся только кратким описани¬ем частей микроскопа.
Оптическая система микроскопа, составляющая его основу, представ¬лена двумя системами линз:
а) объектив — обращен к объекту, дает изобра¬жение увеличенное, но обратное;
б) окуляр — обращен к глазу исследовате¬ля, увеличивает изображение, но делает его мнимым, оставляя обратным
Таким образом, в результате совместного действия обеих систем линз изображение получается увеличенное, обратное и мнимое. Объектив и оку¬ляр заключены в металлическую трубку — тубус, нормальная длина которого равна 160 мм. Современный микроскоп имеет несколько объективов с раз¬ным увеличением. Они закреплены в металлической оправе, называемой револьвером.
Помимо оптической системы, в микроскоп входят зеркало, предметный столик и осветитель. Зеркало помещается в нижней части штатива микроско¬па Оно служит для отражения лучей, падающих на него от источника света, в сторону исследуемого объекта. С одной стороны зеркало вогнутое, с другой -плоское. Для более интенсивного освещения пользуются вогнутым зеркалом. Предметный столик служит для помещения на нем исследуемого объек¬та. Через отверстие в середине столика проходит пучок лучей, отбрасывае¬мый зеркалом. Пройдя через объект, они попадают в объектив. Освещение можно регулировать увеличением или уменьшением отверстия в столике. Это достигается при помощи диафрагмы, которая укрепляется с нижней сто¬роны предметного столика
Осветитель — конденсор предназначен для усиления света Он состоит из линз, которые собирают лучи, отбрасываемые от зеркала, и концентри¬руют их на исследуемом предмете. Помещается конденсор между зеркалом и предметном столиком.
Замечательным орудием современного научного исследования, позволяющим более точно изучать строение живого вещества клеток и тканей, яв¬ляется электронный инвертированный микроскоп. Если оптический микроскоп позволяет получить увеличение исследуемого объекта в несколько ты¬сяч раз, то электронные инвертированные микроскопы могут давать увеличения в десятки — сотни тысяч раз. Принцип действия электронного микроскопа схож со световым микроскопом. В электронном микроскопе пучок световых лучей также направляется линзой конденсатора через образец, а полученное изображение уве¬личивается с помощью линз.
Таким образом, световые бинокулярные и электрические инвертированные микроскопы позволяют видеть живые клетки, а питательная среда — сохраняет жизнедеятельность репродуктивных клеток животных in vitro. Поэтому для кратковременного наблюдения за клетками их помещают в жидкую сре¬ду на предметное стекло или чашку Петри. При длительном наблюдении за клетками пользуются специальными камерами - это или плоские флаконы с отверстиями, закрытыми тонкими стеклами, или же плоские разборные ка¬меры. В качестве объектов можно использовать гаметы и эмбрионы живот¬ных, при этом их изучают в специально подобранных средах.
Наблюдения за гаметами и эмбрионами обычно регистрируются в виде фотографий, сделанных с помощью специальных фотонасадок к микроско¬пу. Живые клетки можно снимать и на видеокамеру.
Сравнение светового и электронного микроскопов
(показатели усреднены)
Показатель
Электронный микроскоп
Световой микроскоп
Источник излучения Электроны Свет
Длина волны 0,005 нм при 50 кВ 400-700 нм
Полезное максималь¬ное увеличение 250000 (на экране) х 150
Максимальное разрешение 0,5 им 200-500 нм
Линзы Электромагниты Стеклянные
Объект Не живой, обезвоженный относительно маленький или тонкий, удерживается на маленькой сетке в вакууме (трансмиссионный микроскоп).
Живой, который лежит в чашках Петри и предназначен для различных микроманипуляций (инвертированный микроскоп) Живой или неживой. Обычно лежит на предметном стекле.
Распространенные красители Содержат тяжелые метал¬лы, которые отражают электроны (трансмиссионный микроскоп) Цветные красители
Изображение Обычно черно-белое Обычно цветное
В ряде случаев такая микрокиносъемка дает очень важную информацию. Применяя ускоренную или замедленную киносъемку, можно видеть протекание таких важных процессов, как деление клеток, фагоцитоз, течение цитоплазмы, слияние кле¬ток, т.е. оплодотворение и т.д. В настоящее время широко практикуется кон¬струкция, состоящая из микроскопа и компьютера, при программном обес¬печении которого исследователь получает полную информацию от любого биологического объекта.
Особенности витального метода изучения репродуктивных клеток в биотехнологии следующие:
1. Возможность проведения фундаментальных исследований с целью изучения таких биологически неповторимых и уникальных процессов как разви¬тие гамет и их оплодотворение, развитие предимплантационных.....