Методов лабораторной диагностики бешенства

Содержание

Введение
Инфекционные (заразные) болезни по своей природе существенно отличаются о незаразных и занимают особое место в патологии животных. Эти болезни возникают лишь при внедрении в животный организм возбудителя- патогенного микроорганизма (или продуктов его жизнедеятельности). Отличительной чертой данных болезней является также способность специфического возбудителя передаваться от больного животного к здоровому. Это определяет потенциальную возможность непрерывной передачи возбудителя инфекционной болезни, массовость поражения животных и тенденцию к широкому территориальному распространению. В силу этих особенностей инфекционные болезни представляют собой наиболее опасную группу болезней, существующих в природе вследствие непрерывности эпизоотологического процесса и способных в определенных условиях наносит животноводству большой экономический ущерб, а некоторые из них- передаваться от животных к человеку. Исходя из такой характеристики, инфекционную патологию животных с полным основанием можно отнести к весьма сложной и многогранной проблеме, биологические, ветеринарные и социально-экономические аспекты, которые изучают многие науки, используя соответствующие методические подходы.
К таким инфекционным болезням можно отнести остро протекающую болезнь – бешенство (Rabies).
1.1. Актуальность темы
Несмотря на большие успехи в изучении бешенства в последние годы во многих странах число случаев заболевания бешенством увеличивается, и болезнь наносит немалый урон. В соответствии с выводами комитета экспертов ВОЗ по бешенству, одной из причин его получения является несовершенство методов лабораторной диагностики бешенства (1987г. Женева).
Для диагностики бешенства практическими лабораториями используются следующие методы: микроскопия мазков-отпечатков, для обнаружения телец Бабеша-Негри, РДП, РСК, МФА, РН на мышах и биопроба на лабораторных животных.
Каждый из применяемых методов имеет недостатки в плане чувствительности, воспроизводительности, экспрессности и технической простоты постановки. Метод выявления телец Бабеша-Негри имеет диагностическое значение только при обнаружении типичных, специфических включений.
РДП позволяет выявлять антигены и антитела к вирусу бешенства в долго хранившемся материале, однако материал, консервированный глицерином, формалином и другими средствами для исследования непригоден. Метод малочувствителен и результаты учитывают только через 24-72 часа.
Биопроба и РН на мышах для быстрой диагностики малопригодны, так как учет результатов проводят через 21-14 дней соответственно.
МФА – (метод флуоресцирующих антител) метод быстро выполнимый лабораторной диагностикой бешенства. Однако противопоказано применение МФА для диагностики в течение 3 месяцев после вакцинации, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса. В МФА не подлежит исследованию консервированные пробы и материал, имеющий признаки даже незначительного значения. Для исследования больного число проб метод требует подготовки специалистов в течение 1,5-2 года и опыта исследования.
Разработанный в последние годы метод ТФ ИФА нашел широкое применение в медицинской и ветеринарной практике. Высокая разрешающая способность этого метода обусловлена, главным образом, природной лиганде, степенью очистки компонентов и чувствительностью приборов, регистрирующих наблюдаемый эффект. В целом ряде сообщений указано, что этот метод характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, экспресностью
Несмотря на то, что ветеринарная практика имеет в своем распоряжении большой набор диагностических сывороток и диагностикумов, увеличение номенклатуры, улучшение качества и стандартизации диагностических препаратов для практических лабораторий остается важной задачей.
Для постановки серологических реакций в настоящее время используют антигены, приготовленные из мозговой ткани лабораторных животных, павших после интерецеребрального заражения фикцированным вирусом. Этот метод получения антигена нетехнологичен и небезопасен.
Указанные выше обстоятельства послужили основной предпосылкой для дальнейшего совершенствования средств и методов лабораторной диагностики бешенства. Актуальность работы обусловлена также необходимостью обеспечения ветеринарных диагностических лабораторий безопасными диагностическими препаратами и высокопроизводительными методами.
Данная работа является результатом завершенных исследований по разработке и совершенствованию диагностики бешенства выполненных в ВНИИВВиМ в соответствии с плановыми заданиями по научно-исследовательской работе.
1.2. Цель и задачи исследования.
Целью наших исследования является совершенствование средств и методов лабораторной диагностики бешенства.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
• Разработать метод изготовления универсального культурального инактивированного антигена, пригодного для постановки серологических реакций.
• Изучить и определить оптимальные условия постановки ТФ ИФА для обнаружения специфических антигенов и антител
• Отработать методику постановки ВИЭОФ для экспресс-постановки диагностики бешенства
• Отработать реакцию имуннофлуоресценции с использованием микрокультур клеток ПС для обнаружения антигенов вируса бешенства
• Изучить диагностическую ценность отработанных методов и предложить схему лабораторной диагностики бешенства.
1.3. Научная новизна
Разработан способ изготовления универсального культурального антигена, включающий культивирование вакцинного или фиксированного вируса бешенства в культуре клеток ПС. Отработку клеточного детрита ультразвуком в течение 5 0,5 минут инактивацию препаратом А-24 /1,8,3,6 – диэндометилен-1,3,6,8- тетразациклодеканом/ в течение 45-50 часов при температуре 40С с последующей леофилизацией. На метод изготовления антигена получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Перевиваемую культуру клеток ПС первые использовали для выращивания вируса бешенства. В результате проведенных исследовании разработан метод ТФИФА для выявления специфических антигенов и антител к вирусу бешенства. Отработано реакция иммунофлуоресценции с использованием микрокультуры клеток ПС для выявления специфических антигенов вируса бешенстава.
II. Обзор литературы
2.1. Краткий исторический очерк
Бешенство – остро протекающая болезнь теплокровных животных, характеризующаяся поражением центральной нервной системы. Восприимчивы домашние и дикие животные всех видов, а также человек. Описание бешенства (Lissa, Hydropholia, la Rage, Rabies, Tollwut, La Rabia) встречается в памятниках письменности за 3000 лет до н.э. В эпоху возрождения, затем в XVIII-XIX веках. Бешенству было посвящено большое число работ, в которых высказывались самые разнообразные точки зрения на болезнь и методы борьбы с ней. Научный подход к борьбе с бешенством принадлежит Луи Пастеру – великому французскому ученому, основоположнику современной микробиологии и иммунологии. Луи Пастер доказал тропизм возбудителя бешенство к ткани мозга и добился его ослабления путем перевивок (пассажей) заражении в отличавшейся сокращенным и постоянным (6-7дней) инкубационным периодом для кроликов, был назван фиксированным (Virus Fixe). После дополнительной инактивации путем высушивания над кристаллами едкого калия Луи Пастер использовал спинной мозг зараженного кролика для изготовления антирабической вакцины. Пастер провел большую работу по созданию антирабической вакцины и ее внедрению в практику борьбы с бешенством.
Новейшие достижения по размножению вируса в культуре клеток позволяли получать антирабические препараты, не обремененные белками мозга (продуцентов). Начиная с Ш.Капровского (1965) культуральные вакцины применяются в практике здравоохранения (в СССР вакцина М.А.Селимова для людей; вакцина ВНИ и ТИБП для животных).
В начале 80-х годов в США методом биотехнологий была создана субъединичная вакцина, которая состоит из гликопротеидов вируса бешенства и обладает более высокими иммуногенными свойствами, чем приготовленная из цельного вируса.
Путем экспрессии ДНК, которая кодируются гликопротеидами вируса бешенства получена рекомбинантная антирабический вакцина на основе вируса осповакцин. Она достаточно эффективна, активно индуцирует синтез защитных нейтрализующих антител; однако использование для этой цели вируса осповакцин продолжает оставаться спорным.
Достижение рабиологии не исчерпываются только разработкой вакцин. В нашей стране и за рубежом нашли разрешение многие вопросы эпизоотологии и иммунологии бешенства.
Несмотря на давнюю известность этого заболевания, несмотря на то что бешенству посвящено большое количество работ, касающихся различных вопросов, интерес к этой инфекции не прекратился, а наоборот, они все больше и больше привлекают к себе внимание. Основными проблемами над которыми в настоящее время ведется работа в области бешенства являются:
1. Дальнейшее изучение морфологии и биологии возбудителя с использованием новейшей лабораторной техники.
2. Выявление новых видов диких животных, могущих быть вирусоносителями.
3. Изучение процесса циркулирующим рабического вируса в природе
4. Дальнейшее сравнительное изучение различных штаммов фиксированного и уличного вируса
5. Разработка быстрых и надежных методов дифференциальной диагностики, в особенности, прижизненной диагностики.
6. Разработка новых методов приготовления вакцин.
Проблема профилактики и борьбы с бешенством чрезвычайно важна для всех без исключения, стран и районов, чем объясняется повсеместный интерес к мировому распространению этого смертельно опасного зооантропоноза. Свободны от бешенства только Великобритания, Скандинавские страны (кроме Дании), Япония и Австралия.
В настоящее время бешенство установлено у животных, относящихся к более чем 30 видам. По оценке ВОЗ в мире ежегодно бывают укушенными животными подозрительными по бешенству 1500000 человек, а умирают от бешенства около 1000 человек. Особенное серьезное положение с бешенством в развивающих тропических странах. Самая высокая заболеваемость в Индии (более 50 случаев в год на один млн. человек), Эфиопия (12.6 млн), Шри-Ланка (10,3 млн), Тайланд (7,6 млн). К наиболее опасным по бешенству районам мира относятся значительные территории Южной Америки, обширные районы Канады, Центральной Европы, некоторые районы Африки и Среднего Востока. В США около 5 случаев в год заболевания человека. Подобная географическая неравномерность распространения очагов болезни связано с различными причинами, многие из которых еще недостаточно известны науке.
Основная масса заболевания бешенством животных на территории России за последние годы приходится на Северный Кавказ, Поволжье, Южный Урал, Целинный край. Возможно, это связано с определенным биотопом и видовым составом фауны этих районов.
2.2. Краткая характеристика возбудителей бешенства.
Возбудитель болезни – вирус, относящийся к роду лиссавирусов семейства рабдовирусов. Как и другие рабдовирусы, он имеет пулевидную форму. Длина вирионов – 180мм, диаметр 75-80мм. Вирус удается культивировать в развивающихся куриных и утиных эмбрионах, в культурах некоторых клеток. Штаммы возбудителя бешенства, циркулирующие в природе (уличный вирус), патогенны для всех теплокровных животных. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в центральной нервной системе зараженных животных, особенно в аммоновых рогах и коре больших полушарий головного мозга, в мозжечке и продолговатом мозге. Высокий титр возбудителя бешенства и в слюнных и слезных железах.
2.2.1. Устойчивость вируса и его локализация
Низкие температуры консервируют вирус. Вирус бешенства чувствителен к высокой температуре, pH, формалину. Температура 280С инактивирует его через 28-53 дня, 500С за один час, 600С – за пять- десять минут, 700С- мгновенно. Высушивание без вакуума инактивирует вирус бешенства в течение 10-14 дней. В высушенном материале он гибнет через 15 дней. Ультрафиолетовые лучи убивают его за 5-10 минут. Дезинфицирующие вещества (растворы формальдегида, гидроокись натрия, хлорной извести) действуют на вирус губительно в обычных концентрациях.
Вирус бешенства быстро инактивируется липидорастворителями 0,1% -ным раствором трипсина, устойчив к pH 5-10 при температуре 40С. Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Распространение вируса бешенства по нервным путям впервые было доказано Луи Пастером. При попадании в организм вирус размножается в поперечно-полосатых мышцах, затем через ацетилхолиновые рецепторы проникает в нервные окончания, двигается по законам в центральную нервную систему, где вызывает диффузный энцефалит. Далее вирус бешенства распространяется по нервам центростремительно в различные органы.
В тесте МФА выявляли вирус бешенства в слюнных железах, сердце, легких, селезенке, печени собак, кошек, мангустов. В тесте инокуляции на мышах из ткани сердца эффективность выделения вируса составила 58-62%, почек-62-70%, в слюнных железах 75-84%. При инфицировании штаммом CVS вирус из органов не относящихся к нервной системе выделен не был. Таким образом показано что только уличный вирус бешенства распространяется от центральной нервной системы к другим органам при естественной инфекции, фиксированный вирус бешенства является нейротропным вирусом. В наиболее высоких титрах вирус накапливается в нервной системы зараженных животных особенно в таких отделах головного мозга, как аммоновы рога и кора больших полушарии, мозжечок и продолговатый мозг.
2.2.2. Антигенная структура
Вирус бешенства отнесен к группе рабдовирусов, имеет сложное строение и содержит около 22% липидов, 3% углеводов, до 1% РНК и 74% белков.
Зрелый вирион имеет молекулярную массу 475*106 Д, диаметр вирионов 70-80 НМ, длина 180-200 НМ. Центрифугирорвание вируса бешенства в градиенте хлористого цезия показало гетерогенность вирусных частиц. Для большинства из них плотность достигает 1,2 грамм/см. в кубе. Центрифугирование зоны градиента сахаразы дало возможность определить для вируса бешенства коэффициент седиментации 23S и 10 S (для материала из культуры клеток). Их плотность в растворе CsCl-1,26г/см3.
У всех рабдовирусов геном представлен единой односпиральной линейной молекулой минус –РНК, содержащий 12000 нуклеотидов. Виток спирали равен 75 А, а его диаметр 150 А. Ширина выпрямленного нуклеопротеида варьирует от 20 до 65А, длина может достигать 4,2м нуклеокапсид содержит 96% протеинов и 4% РНК.
Если на очищенный вирион воздействовать дезоксихолатом натрия (или 2 меркаптоэтанолом, сапонином, твин-80-эфиром), затем привести иммунноэлектрофореза на гемполиакриламида, то можно получить определенное число, молекулярный вес и структуру полипептидов вируса бешенства.
Геном кодирует 5 белконуклеопротеидов, 2 мембранных белка М и NS, гликопротеид G, РНК полимеразу. Белок непосредственно связан с РНК, у всех рабдовирусов сходен и по классификации Wagner и др. (1972) обозначается как белок N. Один вирион приобретает устойчивость к РНК-азе. РНП способен связывать комплимент и не обладает гемагглютинирующей активностью.
Нуклеокапсид вируса бешенства представляет собой спиральные тела, состоящий из белков N, NS и L, составляющие 96% его массы, белок N вирионный РНК, защищающий ее от действия РНК-азы, высокомолекулярный белок L и небольшой белок NS не связанный с нуклеокапсидом и содержатся в вирионе в незначительном количестве. Внутренним белком вирусной оболочки является негликозилированный мембранный или матриксный белок. Кроме белка M у вируса бешенства состав внутреннего слоя оболочки входит белок А или клеточный актин с молекулярной массой 43кДж, содержание которого достигает 1-5 % массы вирионных белков. До недавнего времени считалось, что все штаммы вируса бешенства имеют одинаковый АГ состав. Однако с помощью монАТ удается легко различать фиксированные и дикие его штаммы как по нуклеокапсидным, так и по гликопротеиновым АГ. В вирионах вируса бешенства обнаружено 5 белков. Гликопротеин G способен индуцировать образование ВНА и защищать животных от заражения. Нуклеокапсидный АГ индуцирует образование КСА и ПА.
Нуклеокапсидный антиген индуцирует образование комплиментсвязывающих и преципитирующих антител, ответственных за иммунохимическую окраску вирус специфических антигенов, присутствующих в инфицированных клетках. Эти антитела не обладают вирусонейтролизирующей способностью. Поэтому животные иммунизированные нуклеопротеидом не приобретают защиты против бешенства.
К нуклеокапсиду прилегают мембранноподобный слой, представляющий собой нефосфорилированный белок, матричный белок (М) предположительный его функцией является оттягивание звеньев РНП в цилиндр со спиральной симметрией, один конец которого как бы срезан, а другой имеет форму полусферы. Третий слой образует единый для всех рабдовирусов белок G представляющий собой гликопротеид. Он образует структурную основу для поверхностных отростков, выступающих из мембранных белков, покрытых в этих участках липидами. Их длина 80 и .....