Рекомбинантты ДНҚ клондау. Биология, 11 сынып, дидактикалық материал.

Рекомбинантты ДНҚ молекуласын клеткаға тасымалдау және ген клонын көбейту

1.рДНҚ-ны клеткаға енгізу

2.Ген клонын көбейту

 1.Рекомбинантты. ДНҚ-ны клеткаға енгізу. Гибридті молекулаларды клеткаға енгізу тәсілі векторға байланысты. Егер вектор ретінде плазмида қолданылса, онда енгізу трансформация типімен, егер фаг қолданылса, онда трансфекция (клетканың фаг ДНҚ-сы арқылы инфекциялануы) типімен өтеді. Трансформация мен трансфекцияның жалпы жолы бактерия клеткасын кальций тұздарымен(Са С1₂) өңдегенде, олардың мембраналарының ДНҚ-ны өткізе алатындығына негізделеді. Экзогенді (бөтен) ДНҚ-ның клеткаға ену тиімділігі төмен. Алдын ала СаСІ₂-мен өңделген клеткаға, мысалы, 1 мкг рВR322 плазмидасын қосса, онда әрбір 10⁴—10⁵ плазмиданың біреуі ғана клетканың ішіне енеді яғнибактериялардың азғантай бөлігі ғана

трансформациялана алады. Оларды басқалардан бөлу бактерия клондарын алу процесінде іске асады.

Әдетте, модификацияланбаған ДНҚ молекуласын (метилаза ферментімен метилденбеген) бактерия клеткасының рестрикциялық ферменттері ыдыратып жіберетінін біз білеміз.Ал, клеткаға рекомбинантты ДНҚ молекуласының көп мөлшерін енгізсе, онда оның рестриктаазлары оларды ыдыратып үлгере алмайды. Бактериялық рестриктазалар кесіп үлгірмеген рДНҚ-ның біраз бөлігі рестриктаза танитын орындарда метилденіп — модификацияланып кетеді. Ғалымдар генетикалық инженерия тәжірибелерінде рестрикциялық ферменттері жоқ бактериялық клеткаларды жиі қолданады. Мұндай рестрикцияланбайтын клеткаларда әдетте модификациялаушы ферменттер де жоқ болады.

2.Ген клонын көбейту. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарга егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1см² бетіне 1—10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық клеткалар бөліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының көптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзейді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық клеткадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын көптеген клеткалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір клеткасы да өз клонын түзейді (позитивтік колония).

Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді.Фаг ДНҚ-сы (енбеген клеткалар агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді.Ал, фаг ДНҚ-ы барбактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтікшоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген фагтардың пайда болуынабайланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойын бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген ДНҚ-ныңкопиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады.

М13 фагы клетканы лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар көбейген орындарда бактериялық клетканың бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы көмескі газонда мөлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы газонда қажет рДНҚ молекулалары енгенбактериофагтардың көбеюі өтеді.

Қазіргі кезде ген инженериясында ген клонын көбейтудің екі әдісі кең қолданылуда: геномның жеке фрагментін (кДНҚ-ны қажет геннің иРНҚ молекуласынан кері транскрптаза ферменті көмегімен алу) және барлық геном клонын көбейту.

Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту әдісін организмнің қайсы клеткаларында кажет белок синтезделетінін білгенде ғана алуға болады. Оның үстіне белоктың синтезделуі анағұрлым көп мөлшерде өтуі керек, тек сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-ның көшірмелері көп болады және осыған сәйкес көптеген негативтік шоғырларда іздеп отырған геннің 0 көшірмелері бар деп есептелінеді.

Бірқатар жағдайларда белок синтезделетін клеткаларды табу мүмкін болмайды, ал кейде қажет белоктың синтезделуі мардымсыз өтеді. Осыларға байланысты геномның қажет фрагментін (генін) синтездеу іскеаспайды, өйткені матрицалық иРНҚ-ны клеткадан бөлу өте қиынға соғады. Мұндай жағдайда ген клонын көбейтудің екінші — геномның барлық ДНҚ-сының клонын көбейту әдісі колданылады.Барлықгеномныңклондарын көбейту. (ДНҚ-ның жеке фрагментініңклонын көбейтугеқарама-қарсы) шотган-эксперимент (ағыл. shotgun — бытыра мылтық: бірнешебытыраның бірі нысанаға тиедіяғни көптеген гендерден қажет біреуін сұрыптап алуға болады) деп аталады. Бұл әдістің мәні-кез келген организмніңжоғары молекулалы ДНҚ-сын механикалықтүрде (мысалы гидродинамикалы әдіспен немесе ультрадыбыстың әсерімен) немесе рестриктазалармен әр түрлі фрагменттерге ұсақтайды. Соңғы кезде рестриктазаларжиі қолданылады. Мұнда кажет геннің құрылымы белгісіз болғандықтан, алдынала рестриктаза таңдаумүмкін емес, сондықтан тәжірибеде бірнеше ерекшерестриктазалар қолданылады және олардың бірі организмнің басқа гендерімен қатар қажет генді де үзе алады деп есептелінеді. Басқаша айтқанда бұл әдіс арқылы табиғи генді бөліп алуға болады. Ары қарай бөлінген көптеген әр түрлі ДНҚ фрагменттері векторларға жалғанады.Міне,осындай организмнің барлықгеномын сипаттайтын.рДНҚ-лар жинақтамасы генотека немесе гендер жинағы деп аталады. Гендерді генотекада плазмидалық рДНҚ-түрінде (этил спиртінің тұнбасында), әсіресе рекомбинантты лямбда фаг суспензиясы түрінде (температурасы 0°С тең антисептиктер бар ортада) сақтау өте ыңғайлы. Басқа жағдайда рекомбинантты фагтарды бактериялар клондарында да сақтауға болады. Мұндай клондарды оқтын-оқтын жаңа қоректік орталарға ауыстыру қажет. Аталған жұмыстардың көмегімен кез келген организмнің гендер жинағын алуға болады. Бұл қызықтыратын жұмыстың қиындықтары көп, олардың түрлі зерттеушілер әр қилы әдістерді қолданып жеңуде. Қазір әлемнің жүздеген зертханаларында гендер жинағы құрастырылды. Гендер жинағы ғылыми эксперименттік жұмыстарда және биотехнологиялық бағытта қолдану тапты. Олар кез келген генді немесе бірден бірнеше генді бөліп алу көзі және молекулалық генетиканың әдістемелік құралының ажырамайтын бөлігі болып саналады.

Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сәйкестендіріп комплементарлы ДНҚ генотекасы деп атайды, өйткені кДНҚ ешуақытта қажет генге толық сәйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша тізбектер де бар.

Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін қажет гендер жинағының мөлшерінгеномның-молекулалық массасы-(М) мен фрагменттің орта мөлшерін біліп жәнедәлдік деңгейді (Р) таңдап,анықтауға болады:

N =M (n x 1n) -1-P

Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрастыру үшін жоғары дәлдік деңгейде 920 мың клондар қажет. Ген инженериясының классикалық объектісі — Е. Соlі бактериясының гендер жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет-1,4 мың. Сүтқоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 800 мың—1 млн. клондар санынан құралған гендер жинағы қажет.

Эукариоттық организмдердің гендер жинағын алу үшін олардың барлық ДНҚ жиынтығын гидродинамикалық әдіс арқылы фрагменттерге бөліп, вирустарға енгізеді.

Қолданылатын әдебиеттер тізімі.

Негізгі әдебиеттер:

1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, «Білім» 1996.

2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г.

3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надеждыМосква “Мир” 1987 г.

4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г.

5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г.