Разработка методов иммобилизации нефтеокисляющих бактерий рода Pseudomonas на цеолит

Содержание
Введение 3
1.Применение гетеротрофных микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных объектов. 3
2.Основные этапы очистки почвы от нефти и нефтепродуктов 6
3.Углеводородокисляющие бактерии 7
4.Пути активации метаболической активности естественной
микрофлоры (удобрения, сорбенты и др.) 10
5.Цеолит и промышленное использование 11
6.Области промышленного использования цеолитов. 14
7.Улучшитель почвы и удобрение. 17
8.Применение природного цеолита. 19
9.Использование биокатализаторов для очистки нефтезагрязненных
экосистем 23
10.Иммобилизация микроорганизмов и методы иммобилизации 23
Заключение 27
Использованная литература 28
Введение
Нефть и газ известны человечеству с давних времен как горючий и смазочный материал. Кроме того, нефть и газ являются ценным сырьем для производства многих материалов, необходимых человеку в его жизнедеятельности – синтетический каучук, различные пластмассы, синтетические волокна, ткани, спирты и т.д.
Казахстан обладает большими запасами нефти и газа – это его природные богатства, которые играют большую роль в экономике республики и в настоящее время являются ее движущей силой. По доказанным запасам нефти в 30 млрд. баррелей (4 млрд.т ) Казахстан уже сегодня входит в десятку ведущих стран в мире по запасу углеводородов. По разведенным запасам природного газа в 3 триллионов м³ республика занимает 15-е место в мире. Огромный потенциал углеводородов дает возможность нашей республике в течение ближайших 10 лет войти в число основанных экспортеров энергоресурсов в мире, так как уже сегодня является в СНГ одним из основанных его поставщиков.
Успешное развитие нефтегазовой отрасли, рост объемов добычи и экспорта требуют расширения транспортной инфраструктуры, т.е. создания предприятий по транспортировке, хранению и реализации нефти, нефтепродуктов и газа, это в свою очередь приводит к утечке и разливу нефти / 1 /.
Загрязнение природной среды нефтью и сопутствующими загрязнителями – острейшая экологическая проблема во всем мире. Химическое загрязнение почвенного покрова происходит практически на всех стадиях технологического процесса нефтедобычи. Негативное воздействие нефтедобычи обусловлено как непосредственной деградацией почвенного покрова на участках разлива нефти, так и воздействием ее компонентов на сопредельные среды, вследствие чего продукты трансформации нефти обнаруживаются в различных объектах биосферы / 1 /.
Загрязнение почвы нефтью и нефтепродуктами на территориях с активной нефтепромысловой деятельностью приводит к нарушению экологического равновесия и существенному изменению сложившихся биоценозов. Высокие степени загрязнения, как локальные, так и обширные, приводят к гибели растений, животных и микроорганизмов/ 2 /. Поступившая в почву нефть увеличивает содержание органического вещества, емкости поглощенных оснований, изменяет кислотность, тормозит интенсивность протекания биологических и биохимических процессов. В значительной степени уменьшается количество азотфиксирующих, аммонифицирующих и нитрифицирующих бактерий. Следствием этого является ухудшение обеспеченности почвы подвижным азотом. Реакция микрофлоры почвы, загрязненной нефтью, сводится к резкому снижению ее численности и подавлению биологической активности / 3 /. При попадании нефти и нефтепродуктов в почву происходят глубокие и часто необратимые изменения физических, морфологических, физико-химических, микробиологических свойств, а иногда и существенная перестройка почвенного профиля, что приводит к потере плодородия и отторжению загрязненных территорий из хозяйственного использования. Загрязнение водоемов нефтепродуктами снижает их рыбопродуктивность, ухудшает вкус рыбы и может вызвать ее гибель. Обитатели водоемов, подвергающихся действию продуктов нефти, аккумулируют их в своих тканях. Это создает угрозу передачи углеводородов по «трофической цепи» в организм человека. Опасность усиливается тем, что отдельные из этих веществ потенциально канцерогенны.
1. Применение гетеротрофных микроорганизмов для очистки нефтезагрязненных объектов
Большое влияние нефть и нефтепродукты оказывают на микроорганизмы, однако это влияние подчиняется иным закономерностям. Микроорганизмы являются единственной группой организмов, многие из которых обладают высокой способностью использовать углеводороды в качестве единственного источника углеродного питания. Поэтому роль этих живых существ в процессах превращения нефти в природе поистине грандиозна. Наиболее экономически выгодным и безопасным является микробиологическая деградация/ /.
Микроорганизмам, обладающим способностью окислять углеводороды нефти, принадлежит ведущая роль в процессе самоочищения поверхностных водоемов от загрязнения. Они окисляют нефть до простых соединений; утилизируя ее, создают клеточную биомассу, которая в дальнейшем вовлекается в круговорот веществ в природе.
Микроорганизмы, усваивающие углеводороды, широко распространены в природе/ 4 /. Они принадлежат ко многим таксономическим группам бактерий, дрожжей и мицелярных грибов. В большом количестве эти организмы содержатся в почве/ 4 /.
Нефтеокисляющие микроорганизмы являются обычными обитателями гидросферы. Общим для подавляющего большинства культур, выделенных из пресных и соленых водных бассейнов, а также из минеральных и пластовых вод, является высокая олигокарбофильность. Они обладают способностью развиваться при очень низкой концентрации углеводородов в среде; при подобной концентрации коллекционные культуры тех же видов, изолированные из других субстратов, не растут. /2/
Содержание углеводородокисляющих микроорганизмов в воде зависит от ряда факторов; оно коррелирует с количеством нефтепродуктов, загрязняющих водоемы. Этих организмов всегда больше в портах, на путях следования судов и танкеров, в местах, где добывают и перерабатывают нефть. В несудоходных частях водоемов количество этих микроорганизмов в десятки и сотни раз меньше/ /.
Видовой состав бактерий, обладающих способностью вызывать превращение углеводородов нефти в наземных водных бассейнах, разнообразен. По данным различных авторов, они относятся к видам родов Mycobacterium, Corynebakterium, Rhodococcus, Arthrobacterium, Pseudomonas, Bacillus, Bacterium, Chromobacterium, Micrococcus и др. Среди водных углеводородоусваивающих дрожжей выявляются представители различных родов; в пресных водоемах наиболее часто обитают Trichosporon, Candida, Rhodotorula, Sporobolomyces/ /.
Почти все углеводороды при благоприятных условиях способны подвергаться микробному воздействию. Окисление их производится как конститутивными, так и адаптивными ферментами; отношение отдельных видов к различным углеводородам специфично; микроорганизмы, адаптированные к отдельным индивидуальным углеводородам, иногда могут окислять и другие/ /.
Воздействию микроорганизмов наиболее доступны алифатические углеводороды. Их превращение изучено наиболее полно. Показано, что многие микроорганизмы хорошо усваивают н-алканы с длиной цепи С12-С23. Парафины с большим числом углеродных атомов с трудом поддаются микробному воздействию, а углеводороды бензинового ряда использует лишь узкая группа микроорганизмов/ /.
В кинетике превращения нефти существенным фактором является температура. Наиболее активно нефть окисляется при мезофильных условиях (20-28º); ниже 5º процесс происходит крайне медленно. Поэтому в водоемах с низкими среднегодовыми температурами загрязнение нефтью особенно опасно/ /. Выявлено относительно немного микроорганизмов, обладающих способностью усваивать углеводороды при высоких температурах. Интерес представляет группа термотолерантных микроорганизмов, для которых характерно наличие высокого температурного плато (в пределах 37-41º), при котором они активно размножаются. Определены и описаны типичные термофильные споровые аэробные углеводородокисляющие бациллы с оптимумом роста 45-65º (Bac. subtilis, Bac. brevis, Bac. coagulans, и новая разновидность Bac. circulans thermophilusnov. ssp.)/ /. Глубокая деградация углеводородов происходит лишь в присутствии достаточного количества кислорода; при пониженной его концентрации (ниже 1 мг/л) процесс замедляется. В анаэробных зонах разложение углеводородов, как правило, резко тормозиться или почти полностью приостанавливается.
Трудность изучения деструкции нефти в соленых и пресных водоемах обусловлена тем, что этот процесс всегда вызывает ассоциации микроорганизмов. В то же время мы еще не можем в достаточной мере оценить роль отдельных ее компонентов в сложных превращениях углеводородов в природных условиях. Этот процесс находится в зависимости от многих факторов: состава нефти и ее локализации (в пленке, осадке, эмульгированном и растворенном состоянии), концентрации минеральных веществ, степени обеспеченности кислородом и температуры. Установлено, что нефть становится доступной для воздействия микроорганизмов лишь на грани соприкосновения ее с водой.
Важную роль в превращении нефти играют микобактерии и родственные им формы. В их клеточных стенках находятся растворимые пептидо-липиды (эфиры пептидов с миколовыми и обычными жирными кислотами). Количество их в клетках особенно велико при использовании н-алканов. Эти соединения придают клеточной стенке высокую гидрофобность при поглощении углеводородов во время прямого контакта с ними. Углеводороды пропитывают оболочку клетки пассивным путем, солюбилизируясь на ней, и проникают к участкам мембраны, в которых располагаются углеводородокисляющие ферменты. По-видимому, именно этим обусловливается высокая способность данных микроорганизмов усваивать углеводороды/ /. Большую роль в деструкции нефти играет артробактер, представители которого обладают очень богатой ферментной системой и широко распространены в водах. В процессы окисления нефти активно включаются родококки, псевдомонады, а также ацинетобактер, микрококки, бациллы и ряд других микроорганизмов, нуждающихся для своего развития в этих соединениях / /. В условиях водной среды обитания олигонитрофильные представители артробактера, бревибактерий и нокардий, используя углеводороды, играют известную роль в усвоении азота атмосферы. Опытным путем у этих бактерий была установлена способность к азотфиксации при ассимиляции в качестве единственного источника углерода н-алканов/ /.
Наличие у ряда бактерий фимбрий позволяет им удерживаться в местах сосредоточения нефти и облегчает прохождение трофических процессов/ /.
Соотношение микроорганизмов в ассоциациях изменяется в зависимости от условий внешней среды. С большей активностью разложение нефти происходит в поверхностном, наиболее аэрируемом, слое, но часть труднодоступных разложению компонентов может длительное время удерживаться в виде поверхностной пленки. Скорость деградации растворенной, эмульгированной нефти и ее глобул уменьшается с глубиной водного слоя. Весьма устойчивы к разложению углеводороды нефти, осаждающиеся на дно и находящиеся в наиболее аэрируемых условиях/ /.
При деструкции нефти микроорганизмами большую роль играют процессы кометаболизма. В процессе разложения нефти в водных бассейнах вначале происходят разрушение н-алканов и некоторое возрастание количества ароматических углеводородов. Фракции нефти от керосина до смазочных масел средней массы разлагаются быстрее, чем тяжелые фракции. В результате в водоемах количество легкоокисляемых фракций уменьшается и увеличивается относительное содержание тяжело окисляемых. Требуется очень длительное время, чтобы эти соединения также подверглись разрушению/ /. Полициклические ароматические углеводороды и особенно пентациклические тритерпены настолько стойки, что их используют в качестве индикаторов при исследовании разливов нефти.
Таким образом, наблюдаемая на загрязненных нефтью и нефтепродуктами территориях деструкция нефти и нефтепродуктов микроорганизмами свидетельствует о том, что гетеротрофные микроорганизмы, играют большую роль в самоочищении нефтезагрязненных территорий от нефтяного загрязнения.
2.Основные этапы очистки почвы от нефти и нефтепродуктов
В зависимости от степени деградации нефти в почве и ее состава, принципы выбора приемов и методов рекультивации должны быть различными. В настоящее время существует большое количество методов, с помощью которых снижают и ликвидируют загрязнения нефтью и нефтепродуктами.
Технология рекультивации включает в себя четыре основных этапа очистки. На первом этапе очистка проводится с использованием механических методов очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. К ним относят обваловку загрязнения, замену почвы и откачку нефти в емкости. Эти первичные процессы необходимы при крупных разливах нефти и нефтепродуктов, их осуществляют с помощью специального оборудования. Удаление нефти с поверхности почвы проводится с помощью специальных насосов. Сгребание загрязненного слоя осуществляется бульдозерами, экскаваторами, автомашинами, после чего происходит захоронение слоя почвы, загрязненного нефтью. При этом возникает проблема с выбором места их расположения, так как они становятся источниками вторичного загрязнения.
На втором этапе применяют физико-химические методы: промывку почвы, сорбцию нефти и нефтепродуктов с поверхностного почвенного слоя, электрохимическую очистку почвы и т.д. Промывку почвы проводят в специальных установках с применением моющих веществ, детергентов, затем промывные воды отстаиваются в гидроизолированных прудах или емкостях, где впоследствии проводят их разделение и очистку. Среди способов промышленной очистки грунтов большая роль отводится электрохимическому способу. Он основан на использовании поля постоянного электрического тока и предполагает использование специальных устройств для очистки почвы.
На третьем этапе используется биологические методы, включающие применение гуминовых кислот, микроорганизмов и биотехнологии для очистки от нефтяных загрязнений. Применение этих методов способствует росту численности и активности микроорганизмов, участвующих в разложении углеводородов нефти, которые после нанесения их на очищаемую поверхность прикрепляются к пленке нефти на разделе фаз нефть-вода и включаются в процесс биодеградации углеводородов до полного исчезновения компонентов нефти. Поэтому обработка нефтезагрязненных почв активными штаммами нефтеоокисляющих микроорганизмов считается наиболее перспективным методом борьбы с нефтяными загрязнениями. Применение гуминовых кислот также дает хороший экологический эффект, который заключается в быстром восстановлении естественных геобиохимических процессов, поскольку гуминовые вещества обеспечивают устойчивость биосферы к интенсивному антропогенному воздействию/ /.
На четвертом этапе применяют агротехнические приемы: рыхление, внесение минеральных удобрений, химическую мелиорацию и посев трав. С их помощью можно ускорить процесс самоочищения загрязненных нефтью почв с помощью углеводородокисляющих микроорганизмов, входящих в состав естественного микробиоценоза. Рыхление загрязненных почв увеличивает диффузию кислорода, снижает концентрацию углеводорода в почве, обеспечивает разрыв поверхностных пор, насыщенных нефтью, в то же время способствует равномерному распределению компонентов нефти и нефтепродуктов в почве и увеличению активной поверхности взаимодействия. При использовании рыхления создается оптимальный газо-воздушный и тепловой режим, растет численность микроорганизмов и их активность, а также увеличивается скорость биохимических процессов. Внесение биогенных элементов в виде минеральных удобрений, а также посев в загрязненную почву трав с разветвленной корневой системой способствует ускорению разложения углеводородов нефти. /8/
Углеводородокисляющие бактерии
Углеводородокисляющие бактерии можно разделить на четыре наиболее важные группы, в соответствии с той ролью, которую они играют в природе.
Род Pseudomonas
Род Pseudomonas является очень обширным, виды его находятся повсеместно в воздухе, почве, пресной и соленой воде. Известно почти 200 видов псевдомонад, которые являются грамотрицательными палочковидными бактериями, подвижных посредством полярно расположенных жгутиков. Некоторые из них вырабатывают зеленоватый, флюоресцирующий, растворимый в воде пигмент. Образование пигмента обычно не характерно для морских бактерий. Большинство видов Pseudomonas вызывают брожение глюкозы, но не лактозы. Они обычно способны восстанавливать нитраты до нитритов, аммиака или азота. Различие между вышеупомянутыми четырьмя видами бактерий, окисляющих углеводороды, основано на том факте, что только Pseudomonas aeruginosa способна развиваться при температуре 37º С, тогда как оптимальная температура для других видов лежит в пределах 20-30º С. Ps.fluorescens и Ps.putida широко распространенные водные и почвенные бактерии, способные окислять необычайно большое число различных органических соединений. Многие штаммы, патогенные для растений, были сведены в один вид Ps.sуringae, а Ps.boreopolis несколько крупнее, чем Pseudomonas fluorescens. Бактерии имеют вид палочек, единичных или парных, или даже коротких цепочек, размером в среднем от 0,5 до 2 μ. Морфология колоний может быть различной. Патогенные для растений псевдомонады, имеющие желтый пигмент, были объединены в род Xanthomonas. Их пигмент представляет собой бромсодержащее полиеновое соединение. Штаммы Xanthomonas campestris выделяют плохо расщепляемые ферментами полисахариды, которые получают промышленным способом: водные растворы их используют как добавки для повышения вязкости (например, пудингов, диетических супов, типографических красок).
Род Methanomonas в настоящее время считается состоящим из одного вида Methanomonas methanica, широко распространенного в почве.
В некоторых исследованиях виды Methanomonas и Pseudomonas часто смешивались. В противоположность видов, образующим пленку, которые изучал Зонген, микроорганизмы Гуттона давали однообразное помутнение среды и нуждались в начале процесса в углекислоте. Поэтому Гуттон [1948] назвал свою культуру Methanomonas carbonatophila.
Цобелл [1950b] указал на важное значение метанокисляющих бактерий для сохранения углерода в почве. Энергичное выделение метана другими бактериями быстро привело бы к обогащению атмосферы огромными количествами его, если бы не деятельность метанокисляющих бактерий. Этот автор высчитал, что бактерии на одно м² верхнего слоя почвы толщиной в один см могут окислять до 100 мг метана в год. Гуттон [1948] в своих обширных исследованиях метанокисляющих бактерий произвел дальнейшие вычисления для определения средней скорости поглощения метана бактериальной клеткой. Гуттон пришел к заключению, что поглощение метана равно приблизительно 2×10¯¹² мл на бактериальную клетку в час. Другие данные, полученные Гуттоном, заставляют предположить, что метанокислящие бактерии могут производить около 0,4 г углерода бактериальных клеток на каждый грамм использованного метана. /6/
Метанокисляющие бактерии являются облигатными аэробами и поэтому неактивны в морских осадках и всюду, где глубина превышает несколько см. Тайер [1935] показал, что сульфаты не могут служить акцептором водорода для окислителей метана, Цобелл [1946 b] считал, что при окислении метана сульфатвосстанавливающие бактерии не получают необходимой энергии, обеспечивающей их развитие.
Во влажных анаэробных областях могут скапливаться большие количества метана, так как его растворимость в воде изменяется от 36,2 мл/л при 40º С до 73,5 мл/л при 0º С. Если сильно насыщенные воды выходят на поверхность, то аэробные метанокисляющие бактерии могут оказаться неспособными усвоить большую массу метана, и он улетучивается, как это происходит в болотах.
Род Desulfovibrio состоит из небольшой группы строго анаэробных видов, которые характеризуются способностью восстанавливать сульфаты до сульфидов. Они обнаруживаются в почве, пресной и соленой воде и морских илах. Обычно они имеют вид изогнутых палочек или коротких цепочек, и в этом случае похожи на штопор. В некоторых культурах наблюдаются необычно разбухшие клетки Desulfovibrio desulfuricans. Они передвигаются при помощи единичного полярного жгутика, хорошо развиваются в пресной воде и на начальной стадии выделения культуры не развиваются в морской воде, тогда как Desulfovibrio aestuarii предпочитают морскую воду.
Постгейт [1952] изучал механизм восстановления сульфатов этой группой бактерий, пользуясь различными ингибиторами этого процесса.
.....