МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ

Содержание
1. Извлечение сахаров
 Извлечение сахаров водой
 Извлечение сахаров спиртом
2. Анализ водной вытяжки на содержание различных сахаров
 Определение сахаров по Бертрану
 Приготовление раствора перманганата калия
 Приготовление фильтра
 Ход анализа
3. Полумикрометод определения сахаров
 Ход анализа
4. Определение фруктозы и других кетосахаров
 Ход анализа
5. Микрометод определения сахаров
 Ход анализа
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УГЛЕВОДОВ
1. Извлечение сахаров
 Извлечение сахаров водой
Из сырого, измельченного тем или иным способом материала, приготовляют водную вытяжку. В производственных условиях для ориентировочных целей часто ограничиваются отжиманием сока, который и подвергают анализу.
Для приготовления вытяжки применяются следующие способы:
1. Из предварительно грубоизмельченной средней пробы берут навеску, которую дополнительно измельчают или в размельчителе тканей (гомогенизатор), или в фарфоровой ступке. В первом случае навеску помещают в стакан гомогенизатора, заливают нагретой предварительно до 800С водой, экстрагируют в течение 10 мин. Затем новыми пропорциями воды количественно переносят содержимое стакана в мерную колбу и по остывании доводят до метки. Если требуется извлечь сахар спиртом, то поступают точно так же, заменив воду при экстракции 82-х процентным этиловым спиртом.
2. При отсутствии гомогенизатора в фарфоровой чашке (с известной массой) отвешивают 25 грамм из тщательно перемешенной непосредственно перед взвешиванием средней пробы. Навеску количественно переносят в фарфоровую ступку, смывая туда же из чашки остатки навески дистиллированной водой, и тщательно растирают с 2-3г стеклянного песка до однородной кашицеобразной массы (небольшие кусочки тканей, например, кожицы плодов томатов, слив и др. должны быть растерты). Растертую массу количественно переносят в коническую колбу на 250 см3, заливают 150-200 см3 горячей дистиллированной воды и нагревают в течение часа в водяной бане при 75…800С. Через час колбу снимают с бани, переносят содержимое ее в мерную колбу на 500 см3 (удобно переносить при помощи воронки со срезанным концом), ополаскивая несколько раз колбу, в которой производилось извлечение сахаров в бане. После охлаждения вытяжки объем ее доводят до метки и, перемешав тщательно содержимое, фильтруют вытяжку в любую другую колбу. Как только наберется требуемое количество жидкости, приступают к анализу; нет надобности отфильтровывать всю вытяжку, так как объем ее уже определен и взбалтыванием достигнуто равномерное распределение сахаров во всем объеме.
Указанными способами сахара извлекаются одинаково легко не из всех объектов. Для большинства (ягоды, виноград, овощи – брюква репа и др.) более полное извлечение сахара достигает 2-3 кратной обработки новыми порциями воды. Первый раз извлечение проводится на бане в течение 30 мин. Жидкость сливают через фильтр в мерную колбу, заливают 100 см3 горячей дистиллированной воды, помещают опять в баню на 15 мин. Эту процедуру повторяют еще раз. При работе с малоизвестным материалом проверяют полноту извлечения.
При анализе воздушно-сухого материала необходим ряд последовательных экстракций с предварительным растиранием навески в ступке с первой порцией воды и настаиванием в течение нескольких часов (с добавлением антисептиков – тимола, толуола) и с обязательной проверкой полноты извлечения.
Некоторые объекты (томаты, яблоки виноград, лимоны) обладают значительным содержанием кислот, которые могут во время извлечения сахаров при нагревании частично или полностью гидролизовать сахарозу, поэтому если предполагают определять не только общий сахар, но и отдельно сахарозу, необходимо в колбу перед нагреванием на бане добавить мел для нейтрализации объектов, характеризующихся низкой кислотностью, добавлять мел нет надобности.
В вытяжке некоторых объектов, кроме сахаров, присутствуют также и другие редуцирующие вещества, которые искажают результаты анализа или затрудняют фильтрование (белки и пр.). В таких случаях требуется очистить вытяжку (осадителями беков и других веществ).
Обязательно производят осветление вытяжек (осаждением примесей) при анализе винограда, репчатого лука, листовых овощей, кромовых трав, сахарной свеклы. При анализе любого неизвестного объекта рекомендуется проверить сравнительным анализом необходимость осаждения. Более же целесообразно эту операцию проводить во всех случаях.
В качестве осадителей можно использовать:
1) смесь 30%-го раствора сернокислого цинка и 15%-го раствора желтой кровяной соли, которые приливают в равных объемах (по 0,5-1,5 см3);
2) 4% растворов фосфорновольфрамовой кислоты;
3) 10%-й раствор уксусного свинца, избыток которого удаляют фосфорнокислым натрием.
Раствор свинца добавляют по каплям в теплую, не доведенную до окончательного объема вытяжку до прекращения образования осадка. Прибавив некоторое количество раствора, рекомендуется дать постоять вытяжке и затем внести еще 1-2 капли. Если в отстоящей жидкости сохраняется образование значительного осадка, то необходимо продолжать прибавление раствора свинца. Для примера укажем, что чаще его приходится около 1-2 см3, некоторых случаях (при анализе трав, листовых овощей) – до 5 см3 на вытяжку, полученную из навески 25 г. следует избегать избытка соли свинца, так как в последствии он проходит через фильтр и мешает ходу анализа.
 Извлечение сахаров спиртом
При определении сахаров в водных вытяжках объектов, содержащих в значительных количествах крахмал или инулин (картофель, батат, топинамбур, цикорий), могут быть получены искаженные результаты, так как эти вещества частично или полностью переходят в водную вытяжку (декстрины, инулин), которая обычно трудно фильтруется. В таких случаях вместо водной вытяжки готовят спиртовую. Навеску свежего измельченного материала заливают в колбе горячим 96% этиловым спиртом и нагревают на бане с обратным холодильником. Количество прибавленного спирта рассчитывают так, чтобы в результате разбавления спирта водой, содержащейся в навеске, концентрация его оказалась равной 75-80. спиртовые экстракции производят так же, как и водные, т. е. Первую – 30 мин, две последующие – по 10-15 минут на водяной бане при кипении спирта. Полученные экстракты смешивают, отгоняют спирт на водяной бане (лучше под вакуумом), остаток, содержащий некоторое количество воды, переносят водой в мерную колбу, доводят до черты, фильтруют через бумажный фильтр. Осветлять раствором соли свинца обычно не требуется, так как полисахариды в спирт не переходят, а белки если и переходят, то в небольшом количестве (при работе с плодами и овощами). Отогнанный спирт собирают и повторно используют для извлечения сахаров из других образцов (проверяют концентрацию, обычно она около 80).
2. Анализ водной вытяжки на содержание различных сахаров
Из полуфильтпрованной вытяжки (приготовленной по одному из указанных выше способов и доведенной в мерной колбе до метки) берут пипеткой пробы для определения: 1) редуцирующих сахаров; 2) сахарозы.
1. Две пробы по 10-20 см3 (в зависимости от ожидаемого количества сахара) берут в конические колбы на 150-200 см3, добавляют соответствующие реактивы и необходимое количество воды и определяют сахар по Бертрану. При этом определяется сумма моносахаридов – глюкозы и фруктозы. Если результаты титрования параллельных проб сильно расходятся (например, на титрование идет 6 см3, а расхождение между пробами – 0,25 см3), то количество проб увеличивают.
2. Пипеткой берут 50 см3 вытяжки в коническую колбу на 100 см3, добавляют 5 см3 5%-го раствора соляной кислоты (чем достигается 0,5%-я концентрация кислоты в данной пробе), помещают в кипящую водяную баню на 30 мин для гидролиза сахарозы. Через 30 мин колбу охлаждают (или дают остыть), жидкость нейтрализуют щелочью или лучше насыщенным раствором углекислого натрия по лакмусу до слабокислой реакции, переносят в мерную колбу на 100 см3, доводят до метки, перемешивают и, если жидкость мутная или образуется осадок, фильтруют, берут пипеткой 2 пробы по 10-20 см3 и определяют сахар по Бертрану.
В этой пробе определяют редуцирующие сахара (найденные ранее в отдельной пробе), а также сахарозу. Разность между 2-м и 1-м определениями, умноженная на коэффициент 0,95, дает содержание сахарозы.
Прокипяченную с растворами Фелинга пробу для определения сахара нельзя оставлять на продолжительное время, например на час и дольше. Ни в коем случае нельзя прерывать определения. Начатое определения надо сразу же довести до конца, иначе осадок закиси меди может частично окисляться и тем исказить результаты анализа, кроме того, реактивы при длительном нахождении в смеси и соприкосновением с воздухом могут образовать некоторое количество закиси меди, что также исказит результаты анализа.
Если вытяжку готовили, применяя осаждение раствором уксуснокислого свинца, то нет надобности прибавлять толуол, так как свинец предохраняет вытяжку от заражения микроорганизмами.
Если требуется знать на только сумму моносахаридов, но и отдельно содержание каждого из них (глюкозы и фруктозы), то в аликвотной порции и первоначальной вытяжке определяют фруктозу резорциновым методом. Разность между суммой моносахаридов, определенной по Бертрану (или одним из микрометодов), и содержанием фруктозы представляет собой содержание глюкозы.

 Определение по Бертрану
Метод основан на способности редуцирующих сахаров, обладающих свободной карбонильной группой, восстанавливать в щелочном растворе окисную медь в закисную. Сахароза и другие олигосахара, у которых связаны обе карбонильные группы (сахароза) или одна (мальтоза), требует предварительного гидролиза кислотой или ферментом. Задача заключается в том, что определить количество образовавшегося осадка окиси меди, которое строго соответствует количеству сахара в растворе. Осадок закиси меди отделяют и окисляют окисным железом, восстанавливая его в закисное, а последнее в свою очередь также количественно окисляют 0,1 н. раствором перманганата калия. При этом протекают следующие реакции:
CuSO4 + 2NaOH = Cu(OH)2 + 2Na2SO4
Cu(OH)2 + (CHOHCOO)2NaK = Cu(OCHCOO)2NaK + 2H2O
2Cu(OCHCOO)2NaK+RCOH=Cu2O+2(CHOHCOO)2NaK+NaK+RСООН
закись меди кислота
Реактивы: 1) титрованный раствор KMnO4; 5 г в 1 дм3 воды;
2) раствор 50 г сернистого железа (окисного) или 100 г железоаммиачных квасцов в воде + 200 см3 H2SO4, р=1,84; общий объем доводят до 1 дм3 Н2О;
3) раствор CuSO4∙5H2O (40 г перекристаллизованного медного купороса растворяют в 1 дм3 дистиллированной воды);
4) раствор щелочи (150 г едкого натрия растворяют в воде, сюда же добавляют 50 см3 чистого глицерина и доводят до 1 дм3).
 Приготовление раствора перманганата калия
Отвешивают 5 г перманганата из расчета на 1 дм3 (лучше готовить сразу несколько кубических дециметров) в колбу (не мерную) и, прилив около 1 дм3 дистиллированной воды, кипятят 30-40 мин.
Затем колбу закрывают пробкой со вставленной в нее трубкой, и дают остыть. Остальное количество воды, необходимое для титрования раствора (5-6 дм3), так же кипятят и остужают.
После этого раствор фильтруют и через обычный бумажный фильтр прямо в предназначенную для хранения раствора склянку из темного стекла (или покрытую черной краской), в которой уже находится остальная вода, закрывают пробкой и оставляют на несколько дней. Через 4-5 дней определяют титр раствора перманганата калия, который обычно не изменяется в течение 3-4 месяцев. Через 3 месяца титр проверяют (если раствор хранят дольше). Удобно проверять титр по щавелевокислому натрию или по щавелевой кислоте. Титр перманганата калия по кислороду необходимо выразить по меди, так как в таблицах Бертрана представлены весовые значения меди и соответствующие им весовые эквиваленты сахара. Для перевода титра пользуются уравнениями:
Cu2O + Fe2(SO4)3 + H2SO4 = 2CuSO4 + 2FeSO4 + H2O
10FeSO4 + 2KMnO4 + 7H2SO4 = 5Fe2(SO4)3 + 2 MnSO4 + 8H2O
Следовательно, на 2 атома Cu идет 1 атом О. Таким образом, если титр по кислороду равен 1,157, то 126:16=х*1,157, откуда х=126*1,157/16=9,11 мг Cu.
 Приготовление филтра
Для отфильтровывания осадка закиси меди, промывания и его растворения удобно иметь несколько фильтров, приготовленной из стеклянной ваты, и стеклянного песка. Фильтр приготавливают следующим образом. Берут цилиндрические трубки диаметром 30-40 и длиной 100 мм, к которым с одного конца припаяна болееузкая трубка диаметром 6-8 мм (рис.1).
В суженную часть трубки помещают стеклянную или фарфоровую бусинку 1, а затем крест-накрест несколько слоев крупнонарезанной стеклянной ваты 2 и распределяют ее палочкой таким образом, чтобы она закрывала всю суженную часть. Затем кладут более мелко нарезанную стеклянную вату 3, толщина слоя которой должна быть 10 мм, и после того насыпают стеклянный песок 4 сечением 1-2 мм (для этой цели толченное химическое стекло просеивают в начале через сито диаметром 1 мм, а затем оставшуюся на сите часть просеивают через следующее сито диаметром 2 мм). Затем для получения нового слоя в трубку приливают стеклянный песок, пропущенный через сито с отверстиями 1 мм. Толщина каждого слоя должна быть около 15-20 мм, а самый верхний слой фильтра должен состоять из частиц песка, проходящих через отверстие 0,5 мм. Когда стеклянная трубка заполнена, ее многократно промывают водой, чтобы отмыть остатки кислоты и мельчайшие частицы. Фильтр должен легко пропускать теплую воду. Приготовленные таким образом фильтры устанавливают в специальный штатив для одновременного фильтрования 6-8 проб.
Ход анализа
Берут пипеткой 5-20 см3 исследуемого раствора (в зависимости от ожидаемого содержания сахара) в колбу на 200 см3. количество сахара в пробе должно быть не менее 10 и не более 100 мг (предпочтительно 40-60 мг). Определение следует сохранения определенных объемов реагирующих веществ; поэтому если предлагают большое содержание сахара в исследуемой вытяжке, берут 5-10 см3 раствора и добавляют соответственно 15-10 см3 дистиллированной воды. В коническую колбу на 200-250 см3 приливают мерным цилиндром по 20 см3 растворов сернокислой меди и щелочного раствора, содержащего сегнетовую соль и глицерин, осторожно смешивают их, слегка вращая колбу, и кипятят точно 3 мин с момента закипания. Полученному красному осадку закиси меди дают отстояться 1-2 мин.
Если в анализированном растворе сахара очень мало, осадка закиси меди в нем не образуется, и, наоборот, при наличии в растворе слишком большого количества сахара (за пределом его учета) вся медь полностью восстанавливается в закисную, что характеризуются исчезновением синей окраски и большим количеством выпавшего осадка.
В обоих случаях (мало или много сахара) анализ следует переделать, взяв другое количество исследуемого раствора. Если осадка закиси меди не образуется или он так мал, что на титрование идет всего 1-2 см3 раствора перманганата калия, то надо приготовить другую вытяжку: взять большую навеску 950 г), разбавив вытяжку до того же объема, или такую же навеску (25 г) довести до меньшего объема. Тем самым концентрация сахара в растворе повысится. Если израсходована не вся сернокислая медь на окисление на взятой трубе, то уменьшают объем пробы или дополнительно разбавляют раствор в 5-10 раз.
Жидкость фильтруют через фильтр из стеклянной ваты без отстаивания, пользуясь штативом, которой устанавливают на раковине.
Осадок по возможности не переносят на фильтр и отмывают его от щелочи в колбе декантацией, а затем на фильтре горячей дистиллированной водой. Затем под фильтр с осадком подставляют чистую колбу. Помытый осадок закиси меди растворяют в реакционной колбе 10-15 см3 раствора железоаммиачных квасцов или окисного сернокислого железа и переливают на фильтр. Осадок на фильтре размешивают палочкой и дают ему полностью раствориться; обычно он при этом фильтруется без применения отсасывания. Затем промывают колбу теплой дистиллированной водой 2 раза и сливают все через фильтр.
Фильтр сразу же титруют 0,1 н. раствором перманганата калия до появления розового окрашивания (от последней капли). Титрование двух параллельных проб не должно расходиться более чем 0,05 см3, если на пробу идет 6-8 см3 раствора перманганата калия. Если идет 10-12 см3, до допускается расхождение на 0,1 см3.
При вычислении процента сахара объем 0,1 н. раствора перманганата калия, пошедший на титрование, умножают на титр по меди и по номограмме находят, какому количеству сахаров он соответствует.
Содержание сахаров (%) вычисляют по формуле:
где а – количество сахаров во взятом объеме (V1), найденное по номограмме, мг;
V – объем вытяжки, полученной из навески, см3; V1 – проба вытяжки, взятой для определения, см3; m – масса навески материала, грамм.
3. Полумикрометод определения сахаров
Для определения сахаров в пробе 0,1-9 мг может быть использован микрометод, отличающийся от метода Бертана тем, что работа ведется с меньшими объемами растворов сахаров и для титрования применяется более разбавленный раствор перманганата калия. Метод может быть применен для массовых анализов.
Реактивы: 1) раствор сернокислой меди (40 г перекристаллизованного медного купороса растворяют в 1 дм3 Н2О);
2) раствор щелочи (150 г едкого натра растворяют в 500 см3 воды, добавляют 50 см3 чистого глицерина и доводят до 1 дм3);
3) раствор сернокислого железа (растворяют 50 г окисного сернокислого железа или 100 г железоаммиачных квасцов в воде, добавляют 200 см3 H2SO4 (р=1,84) доводят до 1 дм3);
4) 0,01574 н. раствор перманганата калия (навеску 0,5 растворяют в 1 дм3 воды, 1 см3 раствора соответствует 1 мг меди).
 Ход анализа
Для работы используют вытяжку, содержащую примерно 0,1% сахара. Такой раствор в количестве 3 см3 помещают в пробирку, приливают по 3 см3 растворов медного купороса и щелочи с глицерином. Пробирку после взбалтывания помещают в кипящую баню на 6 мин, затем в сосуд с холодной водой и фильтруют содержимое через стеклянной фильтр. Осадок закиси меди дважды промывают горячей водой, выливают промывные воды из колбы Бертрана, тщательно моют и ополаскивают ее (или заменяют другой чисткой).
Определение ведут в параллельных пробах и вычисляют содержание сахара по таблице №6.....