Биология | Бидайдың плазматикалық мембранасындағы Н АТФ азаның активтілігін анықтау

Мазмұны

КІРІСПЕ...........................................................................................................

1.ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ...................................................................................
1.1. Фузикокциндердің ашылуы және химиялық табиғаты........................
1.2. Өсімдіктердің катионмен белсендірілген АТФ-азалары.....................
1.3. Цитокинин медиаторын тазарту және оның бидай тамыры өскіндерінің плазмалық мембрасының Н+АТФ-азасына әсерін зерттеу...
1.4. Цитокининді байланыстырушы белоктар және цитокинин медиаторы........................................................................................................

2. МАТЕРИАЛДАР МЕН ӘДІСТЕР.............................................................
2.1. Зерттеу әдістері мен объектілері............................................................

3. АЛЫНҒАН НӘТИЖЕЛЕР МЕН ОЛАРДЫ ТАЛДАУ............................

ҚОРЫТЫНДЫ................................................................................................

ҚОЛДАНЫЛҒАНӘДЕБИЕТТЕ.....................................................................

КІРІСПЕ

М.А. Айтхожин атындағы молекулалық биология және биохимия институтының ферменттердің құрылымы мен реттелуі лабораториясында ең алғаш рет фузикокцинге ұқсас екінші реттік цитокинин гормоны ашылды. Ол клеткадағы сигналды трансдукцияда маңызды роль атқаратындығы анықталды. Медиатор екінші сатыдағы сигналды беретін зат, себебі гормон тікелей өзі емес медиаторлар арқылы клеткаға әсер ете алады. Сол себептен цитокинин медиаторын зерттеу ғалымдардың қызығушылығын тудырады. Себебі осы цитокинин медиаторы клетка ішіндегі мембранамен байланысқан ферменттерге әсері өте жоғары [1].
Бұл медиатор бидай тұқымының өніп жатқан ұрығында цитокинин әсерінен пайда болады. Фк мен цитокинин медиаторы арасында жақын қатынасты дәлелденген қосыша мәліметтер алуға болады. Бұл жоспарда ФК-нің өсімдік клеткасының плазматикалық мембранасының Н+АТФ- азасының активтілігіне қасиеті бар екені белгілі. Осы себепті бидай өскіндері тамырының плазматикалық мембранасының Н+АТФ- азасына цитокинин медиаторының әсерін зерттеу мүмкіндігі туындайды [2]. Екінші реттік цитокинин гормоны бидай дәніндегі ұрықтық емес бөлігінің плазматикалық мембранасындағы Н+АТФ-азасын активтендірмейтіндігі белгілі болды. Осыған байланысты осы екінші реттік цитокинин гормонының бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н+ АТФ-азасына әсерін зерттеу қажет болды.
Осы себепті зерттеудің мақсаты: бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н+ АТФ-азасының активтілігін жоғарылату.
Осы мақсатқа жету үшін алға қойылған міндеттер:
1. Цитокинин медиаторын бөліп алу;
2. Бөліп алынған цитокинин медиаторының бидай дәнінің алейрон қабатындағы плазматикалық мембрананың Н+АТФ-азасының активтілігіне әсерін қарастыру;

1.ӘДЕБИЕТКЕ ШОЛУ

Гормондар– тірі организмдердің тіршілігі үшін маңызы өте зор. Организмдердің дамуы, өсуіндегі ең негізгі процестер гормондармен реттелуге тәуелді. Гормондар жетіспеген жағдайда немесе артып кететін болса онда организмді ауруға ұшыратады [3,4].
Яғни осы қызметтеріне қарап гормондарды-организмді реттеуші патшалық деп айтуға болады. Өсімдік тіршілігін реттеуде өсімдік гормоны цитокининнің маңызы зор [5]. Цитокининнің функциясы өсімдік онтогенезінің барлық кезеңдерінен көрінеді. Цитокининді зерттеу аймағындағы жаңа жетістіктер мен көріністерге кейінгі жылдары ғалымдардың қолы жетуде.
Цитокинин– клетка бөлінуін реттейді, хлоропластардың дифференцациясына қатысады. Клетка бөлінуі үшін цитокининнің маңызы зор. Осы гормонның сигналды трансдукция механизмі әлі анықталмаған. Кейінгі зерттеулердің барлығы дерлік өсімдік фитогормондарының өсу процесіне, клетка бөлінуіне әсерін зерттеу бағытында жүргізіледі. Фитогормондар клеткамен клетка, ткань мен ткань, мүше мен мүше байланысқанда көптеген морфогенетикалық және физиологиялық программаларды атқарады [6].
Фитогормондар өсімдік организміндегі заттардың мөлшеріне, маңыздылығына, көбею ерекшелігіне, клетканың бөлінуіне, тыныс алуға, қартаюға, зат алмасуға қатысады. Өсімдік тіршілігін реттеуде өсімдік гормоны цитокининнің маңызы зор [7].
Цитокининнің функциясы өсімдік онтогенезінің барлық кезеңдерінен көрінеді. Цитокининді зерттеу аймағындағы жаңа жетістіктер мен көріністерге кейінгі жылдары ғалымдардың қолы жетуде.

1.1. Фузикокциндердің ашылуы мен химиялық құрылысы

Фузикокцинді (ФК) 1964 жылы италияндық ғалым Alessandro Ballio Fusicoccum amygdale фитопатогенді саңырауқұлағының фитоитоксині ретінде ашты. Бұл фитоксин жас миндаль ағаштарының жапырақтарының саңылауларын ашқан да, осыдан соң олар жабылмаған [7,8]. Артық транспирация және тамыр жүйесінің әлсіздігінің нәтижесінде жас ағаштар тез кеуіп кетеді, яғни фузикокцин табиғи дексикант болып табылады. Профессор A.Ballio лабораториясында осы фитотоксиннің құрылысы анықталынды (1-суретте көрсетілген )
Фузикокциннің гибберлиндер сияқты табиғи терпеноидтарға жататындығын Gronevald авторларымен бірге ескере отырып, гибберлиндер мен фузикокциннің туыстығы туралы гипотезаны шығарды. Бұл екеуі де ауру саңырауқұлақтардың дитерпеноидтары, метаболиттері болып табылады. Уақыт өткен сайын гиббереллиндердің саны артуда. 1960-1980 жылдардын бері сол сияқты фузикокциндердің де 15-ке жуық топтары белгілі болды. Олар А,В,С символдарымен ажыратылады [9].
Жоғары сатылы өсімдіктерде фузикокцин тұқымдасына жататын заттардың бар болуы туралы алғашқы мәліметтерді 1980 жылы Муромцев қызметкерлерімен бірге тұңғыш рет баспадан басып шығарды. Кейін фузикоцинді табу үшін жоғары қысымды сұйық хроматографта материалды алдын ала фракционерлейтін хроматоспектрометрияны қолданды. Бастапқыда авторлар Fusicoccum amygdale саңырауқұлағының културальды сұйықтығында фузикокцинді метаболиттерді анықтаудың тәсілдерін ойлап тапты, ол газды хроматография мен трисилил туындыларының масспектрометриялы аралас әдісі, мұнда детектирлеу бірнеше таңдалған сипатталған иондармен жүзеге асады [10].
Авторлар фузикокцинді алу үшін жүгері собығын және орамжапырақ жапырақтарын қолданды. Оларды этил спиртінде гомогенизирледі. Спиртті экстрактыларды концентрлеп, концентратты хлороформмен экстрагирледі. Хлороформды экстрактыны сұйық хроматографиядан өткізді. Алынған пикті ізінше масспектрометриямен жүретін газ сияқты хроматографияға сынады.
Өсімдіктегі экзогенді А фузикокциннің құрамы 10-10-10-12М құрады, бұл эндогенді гибберлиндердің құрамынан 2-3 есе төмен. Бұл жерден жоғары сатылы өсімдіктерден табиғи фузикокциндердің препаратты мөлшерін бөліп алу мәселесі күрделі екендігі анық болып отыр [11].
Кейінірек жоғары сатылы өсімдіктерден табиғи фузикокцинді бөліп алудың тағы да бір мүмкіндігін осы авторлар қолға алды. Бұл жерде авторлар фузикокцинді бөліп алудың обьектісі ретінде қарқынды өсуімен ерекшеленетін трансформацияланған қына тамырларының культураларын пайдаланды. Бұл обьектіні таңдап алу себебі төмендегідей, біріншіден фузикокциннің көзі болып табылатын микроорганизмдер мен саңырауқұлақтардың зақымдану мүмкіндігі толығымен болмады. Екіншіден, олардың қарқынды өсуіне байланысты тамыр клеткаларының культурасын көп мөлшерде алуға болады [12].


1 сурет Fusicoccum amygdali Del. Фитопатогенді саңырауқұлағының фузикокцин - фитотоксин формуласы (1964 жылы Ballio et all сипаттаған)


Тамыр клеткаларының культураларынан авторлар спиртті экстрактыларды алды. Экстрактыларды вакуумның астында буландырып, су қалдықтарын хлороформмен экстрагирледі, одан соң сулы және хлороформды фазаларда фузикокциннің болуын анықтауды иммунды тәсілмен жүргізді. Фузикокцин хлороформда болды, ал сулы фазада тек іздің мөлшері ғана болды, ал бұл белок және қант қосылыстары сияқты рецепторлар мен антиденелердің тиімді байланысуын тежейді. Фузикокцин сияқты заттарды тамырдың барлық культивирлену кезеңінде тауып отырды (14 тәуліктен бастап). Тазартылған тамырда өсірілген фузикокциннің максимальды құрамы 1кг тамырға 150н моль-ге дейін құрайтынтындығы анықталды [11,13].
Алынған фракциялардың масспектрометрлі анализі мынаны көрсетті: негізінен А типті фузикокцин болды, сондай-ақ берілген анализдер басқа анықталынбаған фузикокциннің болу мүмкіндігін көрсетті. Зерттеулер нәтижесінде эндогенді фузикокцинді идентификациялау қиын деген қорытындыға Муромцев қызметкерлерімен тоқталды.
Алғашқы және негізгі идентифицирленген фузикокциндердің бірі А фузикокцині болып табылады. Ол өз алдына гликозидті үш корбооксилді дитерпендер, молекулалық салмағы 680 кД және формуласы С36Н56О12
ФК молекуласының агликонды бөлігі үш циклді жүйе болып табылады. Бұл жүйе сегіз бұрышты және бес бұрышты сақинаны біріктіреді, сонымен қатар ФК –нің молекуласының агликонды бөлігі тотығу кезінде ацетилді топпен байланысады. ФК-нің 10 шақты түрі моно, ди, үш ацетаттар. ФК басқа қатары өзгеше құрылысты болып келеді. Олардың 20-ыншы көміртегі атомы тотықпаған. Әдебиеттегі мәліметтер бойынша фузикокциннің молекуласы табиғатта кең таралған дициклопентан және циклооккандардың байланысының туындысы болуы мүмкін деген тұжырымдар бар [14]. Мұндай құбылыстар саңырауқұлақтарда, балдырларда, кейбір жоғары сатыдағы өсімдіктерде, тіпті жануарларда (жәндіктерде) байқалған. Фузикокциндердің көптеген түрлері әртүрлі организмдерден бөлініп алынған, мысалы: фузикоплагин С, анаденсин, эпоксидилтимен,т.б. Циклопентанды, циклооканды байланыстары бар терпеноидтар номенклатурасы бойынша фузикоккандар қатарына кіреді. Мұндай фузикоккандардың байланысы транс–син-транс С20-көмірсутек ретінде белгілі болған [14].
Фузикокцинді ары қарай зерттеу олардың физиологиялық, биохимиялық қасиеттерінің алуан түрлі екенін көрсетеді. Бұл жағдай көптеген өсімдіктердің өсуінде табиғи реттеуші екендігіне мүмкіндік береді. Көптеген жоғары сатыдағы өсімдіктердің клеткалары, мүшелері, ұлпалары ФК көлемінің ұлғаюына жауап беруге байланысы бар, сол сияқты саңылаулардың ашылуы, ұрықтың өсуінің қарқыны, көбеюі, т.б. процестерге байланысы бар. ФК және ФК заттар тұқымның өсуіндегі маңызды эндогенді реттегіш болып табылады деген мәліметтер бар. Г.С. Муромцев лабораториясында ең бірінші рет фузикокциндердің тұқымның ризогенезіне активті әсер ететіні анықталған. Фузикокцин асбұршақ тұқымының өсуіне өте қызықты әсер көрсетті. Осылайша ол котилидон клеткаларының өнуін стимулдап отырды да, бір жағынан осьтің ұрықтарының өсуін тежеп отырды, бұл фузикокциннің полярлы әсері бар екендігін көрсетеді [11,14]. Микроорганизммен зақымдалуына маңызды роль атқарады, яғни фузикокцин бұршақ тұқымдастарда түйнектердің түзілуін активтейтіні анықталды.
Фузикокцин жапырақтың бағаналы клеткаларымен көмірқышқыл газын меңгеруін активтейді. Сондай-ақ фузикокцин Vigna angularis калеоптилінің клеткалар апопластарындағы аскорбат концентрациясын реттейді.
Фузикокциндердің гормоналдық қасиеттерінің бірі–оның антистресстік активтілігі. Г.С.Муромцев ФК–нің әртүрлі орта жағдайларында тұқымға әсер етуін дәлелдеген. Өсімдіктер үшін ФК еш күмәнсіз маңызды да, күшті антистресстік байланыс болып табылады . Муромцев қызметкерлерімен бірге өсуге қолайсыз жағдайда тұқымдардың ұқсастығын фузикокцин арттыруға қабілетті екенін көрсетті, мысалы: жоғары және төмен температураларда, артық ылғалдануда, тұздануда және т.б. РАН өсімдіктер физиологиясы институтының қызметкерлері тұқымдарды малу (0,68 мг/л фузикокцин), қыстық бидай, арпа, сұлыға шашырату (0,34 мг/л фузикокцин) арқылы өсімдіктердің аязға төзімділігін арттыратындығын көрсетті. Аязға төзімділіктің артуы фотосинтетикалық аппараттың даму деңгейімен қанттың жиналуымен жақсы коррелирленеді, сонымен қатар, клеткада эндоплазматикалық ретикулумның дамуын жылдамдатумен де ерекшеленеді. Фузикокцин күрішті тұзданудан қорғайтындығы, әртүрлі ауруларға картоп түйнектерінің тұрақтылығын арттыратындығы көрсетілді. Фузикокцин өсімдік үшін ең күшті әсер ететін антистресті қосылыстардың бірі болып есептелінеді [14,15]. Фузикокциннің осмотикалық стреске бейімделу кезіндегі жағымды ролі анықталды.
Біз үшін фузикокциннің биохимиялық активтілігін зерттеу бойынша деректер қажет. Тұңғыш рет 1977 жылы Alessandro Ballio қызметкерлерімен бірге жүгері өскіндерінің ұштарынан бөліп алынған плазматикалық мембранасынан фузикокцинді рецепторларды тапты. De Boer қызметкерлерімен бірге Фк байланыстыратын белоктарды тазалауда арнайы аффинді сорбентте тазалау әдісін ойлап тапты, бұл жерде активті топ ретінде биотинилирленген фузикокцин тігілген [16].
Осы авторлар фузикокцин байланыстырушы белоктарды бөліп алуда жұмыстар жүргізді. Richard G.Stout және Robert E. Cleland фузикокцинді рецепторды зерттеу үшін фузикокцинге қарсы моноклональды антиденелерді алды.
Фузикокцин үшін мүмкін рецепторлар берілген, олар фузикокцин байланыстырушы белоктартың (ФКББ) екі типі. Бірінші типінің константты диссоциациясы (Kg) шамамен 10-11М (жоғары аффинді ВА) болатын фузикокцинге жоғары ұқсастығы бар, ал екінші типінің константты диссоциациясы (Kg) шамамен 10-7М (төмен аффинді НА) болатын төмен ұқсастығы бар рецепторлар. Тұңғыш рет осы рецепторлар жүгері калеоптилінің плазматикалық мембранасы бар функциялардан табылды. Жұмыста белгіленген мембраналарда рецептордың жоғары аффинді сайттары мөлшерінің төмен аффинділірге қатынасы - [ВА] / [НА] шамамен 1-ң 2-ге қатынасын құрайтындығы көрсетілген. Авторлар фузикокцин әсеріннен тек жоғары афиндік сайттың байланысуы қатысады деген тұжырымға келді. Мұндай көзқарастар кейінгі жылдары басымдылық таныта бастады. Фузикокцин рецепторы ретінде жоғары аффинді сайттың қатысуы фузикокцин байланыстырушы белоктан және Н+АТФ–азадан құралатын in vitro жүйесінің реконструкциясы бойынша жұмыс істеген авторлармен болжамдалады [17].
Көптеген оқшауланған мембраналарда төмен аффинді сайттардың аз ғана мөлшері немесе жоқтығы бөліну процесінде олардың инактивациясымен байланысты болуы мүмкін. Бұл жоғары аффинді сайтпен салыстырғанда төмен аффинді сайттар байланысының үлкен лабильділігімен түсіндіріледі....